这里描述的是一种确定HIV-1限制程度的既定方法,由细胞抑制蛋白SAMHD1。人髓系U937细胞用共表达YFP的SAMHD1表达载体转导,分化,然后用HIV-RFP攻击。限制水平由流式细胞术分析确定。
无菌α-基序/组氨酸天冬氨酸结构域含蛋白 1 (SAMHD1) 抑制静止髓系细胞中 HIV-1 的复制。由于SAMHD1 RNA表达水平低,U937细胞被广泛用作分析SAMHD1活性的便捷细胞系统,导致内源性蛋白表达检测不到。基于Stoye实验室开发的用于表征其他逆转录病毒限制因子的类似测定,Bishop实验室开发了一种双色限制性测定法来分析U937细胞中的SAMHD1。小鼠白血病 表达SAMHD1的病毒样颗粒以及从IRES表达的YFP用于转导U937细胞。然后用醋酸佛波肉豆蔻酸酯处理细胞,以诱导分化为静止表型。分化后,细胞感染表达荧光报告基因的HIV-1病毒样颗粒。48小时后,收获细胞并通过流式细胞术进行分析。将表达SAMHD1的群体中HIV感染细胞的比例与缺乏SAMHD1的内部对照细胞的比例进行比较。这种比较揭示了一个限制比率。SAMHD1表达导致HIV感染减少五倍,对应于0.2的限制比。我们最近用RFP代替原始GFP作为HIV感染的报告基因,促进了流式细胞术分析。
该测定已成功用于表征氨基酸取代对SAMHD1限制的影响,方法是通过转导编码改变的SAMHD1蛋白的病毒,这些蛋白来源于表达载体的定点诱变。例如,催化位点取代物HD206-7AA显示出限制性表型为1,表明限制性活性的丧失。同样,可以确定不同测试病毒的易感性。该测定可以进一步适应结合分化状态、代谢状态和 SAMHD1 修饰剂的影响,以更好地了解 SAMHD1、细胞代谢状态和病毒限制之间的关系。
无菌α-基序/组氨酸-天冬氨酸结构域含蛋白 1 (SAMHD1) 可阻止人类免疫缺陷病毒 1 型 (HIV-1) 在髓系静止细胞中的复制。SAMHD1通过其作为dNTP三磷酸水解酶的酶活性阻断复制,这导致细胞内dNTP水平降低。因此,HIV-1不能有效地执行逆转录过程。自初步观察以来的几年中已经取得了很大进展,特别是在特定结构域和氨基酸对SAMHD1抗病毒活性的贡献方面。这些见解是使用生化测定以及模拟生理相关静止髓系环境的细胞系统得出的。U937细胞1 被广泛用作分析SAMHD1活性的便捷骨髓细胞系统。这是由于缺乏内源性SAMHD1表达,被认为是由于与表达SAMHD1的细胞相比RNA水平低(正在进行的研究领域)。在这里,该协议描述了U937细胞与共表达SAMHD1的病毒样颗粒和黄色荧光蛋白(YFP)报告基因的瞬时转导,以检查SAMHD1限制HIV-1的机制。这种用于检查逆转录病毒限制的瞬时双色流式细胞术测定首先在Stoye实验室2 中开发,此后已被调整用于研究其他限制因子,包括三方基序(TRIM)蛋白3。受这些测定的启发,Bishop实验室开发了一种双色测定法来分析U937细胞中的SAMHD1限制。
实验的工作流程如图 1 所示。小鼠白血病病毒(MLV)样颗粒含有编码SAMHD1的双顺反子信息以及从IRES表达的YFP用于转导U937细胞。然后用醋酸佛波醇肉豆蔻酸酯(PMA)处理细胞,以诱导分化为静止表型。细胞接下来感染表达红色荧光蛋白(RFP)的HIV-1病毒样颗粒。48小时后,收获细胞并通过双色流式细胞术进行分析。该测定法还与YFP和绿色荧光蛋白(GFP)一起使用,流式细胞术分析所需的标准过滤器组合较少。使用HIV-RFP可以实现更直接的补偿,因此经验不足的流式细胞术用户更容易获得该测定,并且大多数流式细胞仪都可以实现。
在分析过程中,在同一细胞孔中,在表达SAMHD1的细胞和缺乏SAMHD1的细胞之间比较HIV感染细胞的比例。这为孔/流式细胞术管提供了内部控制,这是一个关键特征。转导细胞和未转导细胞中感染水平的比较揭示了限制性比。比率为1.0表示转导因子对感染性没有影响。在该测定中,野生型SAMHD1表达导致HIV感染减少五倍,对应于0.2的限制性比。虽然与更经典的限制性因子(如TRIM5)相比,这种效应是适度的,但这种效应仍然是可重复的,并允许将修饰的SAMHD1表达子分类为那些以等效方式限制野生型蛋白的表达子,那些不能限制的表达子,以及那些具有中间表型的表达子。
该测定已成功用于通过与编码突变体SAMHD1序列的病毒转导来表征SAMHD1结构域和氨基酸突变体的限制性表型。例如,催化位点取代HD206-7AA在该测定中无法限制。同样,可以确定不同测试病毒的易感性。例如,HIV-1逆转录酶突变体更容易受到SAMHD1介导的限制(例如,151V4)。该协议概述了病毒样颗粒(VLP)产生,使用SAMHD1表达载体转导U937,携带荧光报告基因的HIV感染以及随后通过流式细胞术进行分析的详细信息。本文讨论预期哪些数据以及如何避免次优结果。最后,除了检查不同的SAMHD1变体以更彻底地了解SAMHD1,dNTP水平和病毒感染之间的相互作用外,还概述了该测定的替代用途。鉴于SAMHD1在细胞代谢中心的作用,以及与癌症的其他联系,这仍然是一个引起强烈兴趣的领域。
如上述注释所述,该方案的关键方面集中在保留用于VLP生产的正确细胞表型以及为观察SAMHD1限制创建适当的环境。首先,双色流式细胞术对限制性限制性物质的准确分析依赖于实现适当比例的转导和感染细胞,以便在图的每个区域中有足够的细胞进行分析。因此,研究人员的目标MOI应小于1(见 协议)。转导率和感染率过高或过低会导致分析问题,因为缺乏未感染或双重感染的细胞。同样,要比较的SAMHD1载体的相似转导速率是允许将相同的补偿基质和门控应用于整个实验的关键,从而增加了后续分析的信心。
其次,所用U937细胞的年龄是它们是否成功分化的关键因素。可以通过观察依从性、分化后培养基酸化随时间减少以及测定中野生型阳性对照的充分限制来监测成功的分化。长达 5 天的分化已经成功。
该测定的主要优点之一是其灵活性。SAMHD1的各种修饰版本(结构域,氨基酸,物种序列)可以通过载体的简单定点诱变或克隆进行测试。同样,可以探索测试病毒的变种。该测定先前已用于证明结合dNTP能力降低的HIV-1逆转录酶突变体对SAMHD1限制更敏感。相同的原理可用于测试SAMHD1对其他病毒的限制。此外,不同的分化条件或人工操纵细胞内dNTP浓度可用于进一步探测细胞内条件与SAMHD1活性之间的相互作用,这是Bishop实验室积极研究的领域。还描述了SAMHD1与各种核苷逆转录酶抑制剂的相互作用,并且使用该测定修饰用于原代细胞12,13,14,15的SAMHD1的作用显示。
调整方案以用于原代细胞克服了检查转化细胞中代谢表型所带来的限制。然而,现有形式为高通量分析提供了一种方便且技术挑战性较小的方案,特别是使用带有高通量进样器的流式细胞仪。在调整方案时,应考虑内部未转导细胞对旁观者效应(例如免疫信号传导)的敏感性。
与细胞生物学的许多方面一样,必须将此类测定用作理解给定现象的整体方法的一部分。并行使用SAMHD1活性16的生化测定,细胞内dNTP池的定量,以及观察人类, 离体 和动物模型中的SAMHD1突变表型(由世界各地的实验室进行,其中一些在本期中描述)是不断发展理解这种复杂蛋白质的关键。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了弗朗西斯·克里克研究所的支持,该研究所的核心资金来自英国癌症研究中心(FC001042和FC001162),英国医学研究委员会(FC001042和FC001162)和威康信托基金(FC001042和FC001162)以及JPS的威康信托研究员奖(108012 / Z / 15 / Z)。剑桥大学的工作由NIHR剑桥生物医学研究中心,伊夫林信托基金(16/21),玫瑰树信托基金(M590)和英国医学研究委员会(MR / S009752 / 1)共同资助。后者由英国资助,是欧盟支持的EDCTP2计划的一部分。
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
0.45 µm syringe filters | Sartorius | FCT122 | |
10 cm dishes | Corning | 430167 | virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks – see transfection reagent guidance |
12 well plates | Greiner | 665180 | |
24 well plates | Greiner | 662160 | |
BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | 649225 | alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence |
DMEM | Sigma | D6429 | ATCC recommends Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate. |
DMSO | Fisher | BP-231-100 | |
fetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
Flowjo | BD Bioscience | – | alternative analysis software can be used |
light microscope | – | – | Any bright field light microscope |
p8.91 | – | – | HIV GagPol expressor (PMID: 8602510) |
paraformaldehyde (4 % in PBS) | Alfa Aesar | J61889 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P8139 | |
polybrene | Sigma | TR-1003 | |
pKB4 | – | – | Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841) |
pLGatewaySAMHD1eYFP | – | – | MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1). |
pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY FP |
– | – | As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues |
Prism | Graphpad | – | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable |
pVSV-G | – | – | VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/) |
RPMI | ThermoFisher | 21875034 | |
screw-cap tubes | StarLab | E1415-2231 | |
SCRPSY | – | – | HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/ |
stripettes 10 mL | Corning | 10084450 | |
stripettes 5 mL | Corning | 10420201 | |
TrypLE express | Gibco | 12604021 | Trypsin will also be suitable |
Turbofect | ThermoFisher | R0531 | alternative transfection reagents will also work well |
U937 cells | ATCC | CRL-1593.2 |