巴库洛病毒表达载体系统 (BEVS) 是用于生化、生物物理和结构研究的蛋白质精氨酸甲基转移酶 (PRMT) 表达筛查和生产的强大平台。可用于大多数PRMT和其他需要真核表达平台的兴趣蛋白质,可生产毫克量的材料。
蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMTs)甲基酸精氨酸残留在多种蛋白质上,在许多细胞过程中发挥作用。PRMT 可以对称或不对称地对称地使用单或二甲基酸精氨酸瓜尼迪诺组。这些蛋白质的酶学是一个复杂而经过严格研究的领域,需要毫克量的高质量重组蛋白。 采用多 核病毒(AcMNPV)和 斯波多普泰拉节俭 9(Sf9)昆虫细胞的巴库洛病毒表达载体系统(BEVS)已用于表达筛查和生产许多PRMT,包括PRMT 1、2和4至9。为了同时筛选这些蛋白质的多个构造的表达,包括域和截断片段以及全长蛋白质,我们应用了可调节和可编程多通道移液器的可扩展方法,以及 24 和 96 井板和方块。总的来说,这些方法的调整使得大规模生成巴氏DNA、重组病毒和蛋白质表达筛查成为可能。使用填充量大的Sf9细胞悬架培养容器有助于克服单批大规模蛋白质生产生产管道中的空间限制。在这里,我们描述了用于生化、生物物理和结构研究的高效和具有成本效益的实用PRMT表达的详细协议。
蛋白质精氨酸甲基转移酶 (PRMTs) 甲基酸酯精氨酸残留物以单甲基或对称/不对称的二甲基方式。重复的RG/RGG/GRG序列是大多数PRMT非常青睐的,存在于各种各样的蛋白质1,2中。精氨酸甲基化蛋白,如组蛋白或转录因子和拼接因子调节转录,拼接,和染色质结构3,4。对PRMT基材和共因子利用、周转和动力学的多样化调节以及选择性抑制剂的产生日益了解,为这些酶及其复合物5、6揭示了机械学的光芒。然而,并非所有的PRMT家庭成员都受到同等程度的研究:例如,PRMT9最近才被发现是PRMT家族1的成员。这些蛋白质的结构和酶功能研究需要充足的,通常是毫克,大量的重组蛋白可用。
大肠杆菌(大肠杆菌)益角质表达系统通常是表达筛查的首选,它利用给定蛋白质7、8、9的多种结构进行表达筛查。然而,基于大肠杆菌的表达并不总是导致足够的PRMT蛋白质在其活性形式,正如我们特别注意到的PRMT5和PRMT7(见下文)。因此,未能用大肠杆菌表达或需要由真核表达机制生产的PRMT被分包成适合替代巴库洛病毒表达载体系统(BEVS)表达筛查的载体。虽然大肠杆菌表示PRMT1、PRMT3和PRMT8的样本已广泛用于体外测定和晶体造像,但其他PRMT,如PRMT5,需要其双甲基转移酶领域的MEP50结合伙伴,而PRMT7和9等PRMT则需要昆虫细胞表达才能获得足够数量的活性蛋白质。总体而言,PRMT4、5、6、7和9的标准化中通量甲基转移酶检测已在昆虫细胞6中利用了 BEVS。巴库洛病毒表达载体系统 (BEVS) 是一个多功能平台,用于生产需要真核表达机制的重组蛋白,这种机制能够进行对生化、生物物理和结构研究10、11、12所必需的转化后修饰。自1983年首次报告使用巴库洛病毒进行蛋白质表达13以来,已有数种 BEVS 上市。这些协议大多采用不同的策略,将表达质粒转移到昆虫细胞中。其中包括巴卡到巴克, 闪光巴, 巴库洛戈尔德明亮, 巴克维克托 – 3000, 巴奇马吉奇, 巴帕克等。我们的协议是基于在BVS中最常用的系统,Bac-to-Bac系统14,这是旨在通过现场特定的转位15将感兴趣的蛋白质(POI,这里为PRMTs)编码到大肠杆菌的特异性菌株中保存的巴库洛病毒基因组。
简言之,含有感兴趣基因的质粒转移载体被转化为DH10Bac 大肠杆菌 能力细胞,以产生重组病毒巴氏DNA。粘附的Sf9细胞随后被巴米德DNA转染。转染后四到五天,初步重组的巴库洛病毒被回收并标记为P1病毒。然后,P1巴库洛病毒库存用于病毒放大(即P2巴库洛病毒库存的生成)和蛋白质表达筛查。根据表达筛选结果,确定了P2病毒,以最佳表达结构的蛋白质,并用于产生巴库洛病毒感染昆虫细胞(SCBIIS)的悬浮培养物,用于大规模蛋白质生产。在这里,我们描述我们的详细协议,并描述我们的试剂和文化容器选择背后的理由,以支持我们的战略,开发一个更省时,经济高效,可扩展的方法,以获得足够的期望的重组蛋白。
BEVS在昆虫细胞中的优势之一是转化后修饰机械能够进行更复杂的改性,如磷酸化、肌疏松和糖化。结合哺乳动物蛋白的高效折叠,这些修饰促进大量的改性和折叠蛋白,适合生理相关的下游实验16。
在此,我们描述了 BEVS 的详细协议,强调在巴库洛病毒表达平台中成功筛选多种PRMT蛋白质和大规模PRMT蛋白生产的关键元素:1) 使用常规、可调和可编程多通道移液器在 24-96 之间传输生物材料 – 在巴氏 DNA 和病毒生成阶段的井细胞培养板和方块:重组病毒的集合,重组病毒病毒体积的放大和蛋白质表达筛选块的制备。2) 用于生成重组病毒的高性能和经济高效的转染试剂。3) 用于大规模蛋白质生产的巴库洛病毒感染昆虫细胞 (SCBIIC) 的悬浮培养。4) 利用高填充体积 2.8 L Fernbach 摇瓶来保持 Sf9 悬浮培养物和 2.5 L Tunair 摇动瓶和 5 L 试剂瓶用于大规模蛋白质生产。
转型和转化步骤的特殊考虑和理由。
虽然商业协议建议使用100μL的称职细胞进行一次转化14,但商用DH10Bac E. 大肠杆菌 能力细胞的转化效率高达1×108 cfu/μg DNA,所以我们只使用4μL。这足以让每个变种人获得孤立的白色重组菌落,用于巴米德DNA分离。24井转染板中的粘附Sf9细胞在无血清昆虫介质0.5 mL的细胞密度为2×10 5/mL时播种。这个体积足以确保井面的均匀覆盖。同时,它不稀释过多的转染混合物,提高转染效率。转染试剂对Sf9细胞无毒,无需介质交换。与介质变化相反,在传输后 4-5 小时,在传输板中添加包含 10% (v/v) FBS 的额外 1.5 mL 介质,以促进细胞生长。两种转染试剂的转染效率都很高。不过,使用 X-tremeGene 9 时,转染细胞(图 2)中的感染迹象比 JetPrime 试剂早 10-12 小时,因此我们根据协议中下一步的工作时间表在这些试剂之间进行选择,这在整个过程中提供了一定的灵活性。
如果从转染板收集并标记为P1的初始重组病毒量是用于蛋白质表达筛查的一个限制因素,则可以使用P2病毒进行蛋白质测试表达筛查。
从小到大文化卷的考虑。
从历史上看,人们认为,在Sf9细胞维护和扩展生产的悬浮培养中,细胞的最佳生长需要高空域。然而,在2014年,据报道,文化船的高空空间比先前认为的17。使用适当调整的摇晃速度设置的培养容器到摇晃平台的轨道抛掷,即使高填充体积悬浮培养物中,通过长时间创建和维护小气泡,也能提供足够的氧气传输。通过这种方法,在不牺牲高细胞生存能力的情况下,在细胞的倍增时间的正常范围内,以更高的摇晃速度培养市售昆虫细胞。
因此,6年前,我们开始增加细胞维护过程中摇动烧瓶中的悬浮培养体积,并在调整和监测摇晃条件时引入了不同类型的蛋白质生产培养容器(图6)。为了在这些培养容器中建立最佳条件,我们监测了Sf9细胞培养参数,如细胞倍增时间以及细胞的生存能力、大小和形状、聚合状态和细胞的可感染性。
例如,对于 Sf9 细胞维护,在 2.8 L Fernbach 摇动烧瓶中,我们培养 2 L 而不是 0.8 L 的 Sf9 悬浮细胞在 27 °C 的 150 rpm 下摇晃,大多数时间细胞的生存能力接近 99%,具有均匀形状的健康分裂细胞。为了扩大生产,我们在25°C的较低温度下,以145 rpm的速度在5升试剂瓶中感染4升细胞。 内置摇动平台的最常用的孵化器可容纳 6 x 2.8 L 摇动烧瓶或 6 x 5 L 试剂瓶,或 10 x 2.5 L Tunair 摇动烧瓶。因此,一个摇动平台的容量,如果我们填补Fernbach摇瓶和试剂瓶到1/3与船舶的高填充量是4.8 L对12L使用2.8L芬巴赫摇瓶和10L对24L使用5L试剂瓶(图6)。高填充量养殖船的悬浮细胞培养维护和规模化生产,有助于我们克服产量限制,采用大型平台。因此,这对无法获得生物反应器和/或生产管道中空间有限的实验室非常有用。
该协议可以很容易地适应生产和纯化蛋白质结构与不同的亲和力标签,利用适当的脂质和修改纯化缓冲器,如SGC发表的论文6 描述的PRMT4,7,9,和他的标签PRMT5-MEP50复合物和PRMT6的旗标记全长蛋白质。虽然我们描述了PRMT蛋白质家族的 BEVS 协议,但同样的方法可以应用于任何其他蛋白质家族。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢达利娅·巴赛特-洛夫乔伊抽出时间对手稿和我们所有与PRMT蛋白家族合作的同事提供有价值的反馈和批评意见,这些同事都来自巴库洛病毒表达载体系统。
SGC 是一个注册慈善机构(编号1097737),接受拜耳股份公司艾伯维的资金, 博林格·英格尔海姆、基因科技、加拿大基因组通过安大略基因组研究所[OGI-196]、欧盟和EFPIA通过创新药物倡议2联合承诺[EUbOPEN赠款875510]、詹森、默克KGaA(加拿大和美国的EMPD)、辉瑞、竹田和威康信托[106169/ZZ14/Z]。
2.8L Nalgene Fernbach Culture Flask, Polycarbonate, | Nalgene | 29171-854 | For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells |
24-Well Blocks RB | Qiagen | 19583 | For incubation of 4ml of suspension Sf9 cells for protein expression screening |
4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul | Biorad | 5671095 | For SDS-PAGe analysis of the purified proteins |
50ml Reagent Reservoir | Celltreat Scientific Products | 229290 | Reservoir used for diluted transfection reagent and Sf9 cells suspension |
96-well cap mat, for use with square well, 2 mL | Greiner Bio-One | 381080 | Used to cover 96 well block |
96 well PCR plate | Eppendorf | 30129300 | |
Bacto agar | BD | 214010 | For LB-agar selection paltes |
Airpore Tape Sheets | Qiagen | 19571 | To cover 24 well blocks for protein expression screening |
Allega X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
Antibiotic Antimycotic (100x) | Gibco | 15240112 | |
Bacmid DNA | in-house | non-catalog item | Bacmid DNA for baculovirus production |
Bluo-Gal, 1g | Thermo Fisher | 15519028 | |
Beckman JLA 8.1000 | |||
Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile | Eppendorf | 30722116 | Tissue culture treated plate |
Cell Resuspension Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCRS500 | For Bacmid DNA extraction |
Cell Lysis Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCLS500 | For Bacmid DNA extraction |
CELLSTAR Tissue Culture Plates, 96 well | Greiner Bio-One | 655180 | For transfection mix |
ClipTip 1250, filter reload, sterile | ThermoFisher Scientific | 94420818 | Tips for programmable and adjustable multichannel pipette |
dNTP Mix (25 mM each) | Thermo Fisher Scientific | R1121 | |
E1-ClipTip Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672090BT | Programmable and adjustable multichannel pipette |
E4 XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 μL | Ranin | LTS EA6-300XLS | Ranin adjustable multichannel pipette |
Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 µm ultra high molecular weight polyethylene membrane | Agilent | 201005-100 | For protein purification in expression screening |
Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L | IBI Scientific | SS-6003C | For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells |
Gentamicin 10x10ml | BioShop | 15750078 | |
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Wisent Biocenter | 080-450 | |
I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L | Wisent Biocenter | 301-045-LL | Serum free insect cells growth medium |
InstantBlue, Ultrafast Protein Stain | Expedeon Protein Solutions | ISB1L-1L | For protein gel (SDS-PAGE) staining |
Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5% | BioShop | IPT001.100 | |
JetPRIME Transfection Reagent Provided with jetPRIME buffer | POLYPLUS TRANSFECTION Inc | 114-01 | For Sf9 cells transfection to generate baculovirus |
Kanamycin Monosulfate | BioShop | KAN201.100 | |
Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro& | Sigma | L3022-1KG | |
Masterblock 96 deep well 2.4mL | Greiner Bio-One | 780285-FD | Used in the transformation and expression screening procedures |
Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml | Thermo Fisher | 10361012 | Competent cells for bacmid DNA generation |
mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 – 300 uL | Sartorius | Sartorius 725240 | 12 channel pipette |
Neutralization Solution, 0.5 L | Millipore Sigma | LSKNS0500 | For bacmid DNA extraction |
New Brunswick Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in) | Eppendorf | M1282-0004 | Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells |
Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30250 | For protein purification |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | LS15140122 | |
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 500ml | Pyrex | 4444-500 | For suspension culture of Sf9 cells |
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 125ml | Pyrex | 4444-125 | For suspension culture of Sf9 cells |
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 250ml | Pyrex | 4444-250 | For suspension culture of Sf9 cells |
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution | Froggabio | 21141 | |
RNase A, 0.9 mL | Millipore Sigma | LSKPMRN30 | For suspension buffer for bacmid DNA extraction |
Roll & Grow Spherical Glass Plating Beads | MP Biomedicals | 115000550 | For spread of bacterial cells across the surface of an agar plate. |
RT-LTS-A-300μL-768/8 (tips) | Ranin | 30389253 | Tips for ranin multichannel pipette |
S.O.C. Medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian | cytivalifesciences | SH3039602 | Addition to the serum free medim for the transfected cells |
Sf9 cells | Thermo Fisher | 12659017 | Insect cells |
Sfx-Insect Cell Culture Media | Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences) | SH3027802 | Serum free insect cells growth medium |
Tape Pad | Qiagen | 19570 | Tape Pad |
Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer – 2,000 units | New England Biolabs | M0267L | |
Tetracycline Hcl | BioShop | TET701.10 | |
Trypan Blue 0.4% Solution | Gibco | 15250061 | For assessment of cell viability |
VITLAB Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L | VITLAB | V100889 | For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells |
VWR Digital Mini Incubator | VWR | 10055-006 | Incubator for adherent Sf9 cells |
VWR Incubating Microplate Shaker | VWR | 97043-606 | Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks |
VWR Petri Dishes | VWR | CA73370-037 | |
X-tremeGene 9 DNA Transfection Reagent 1.0 M | Roche | 6365787001 | For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus |