Este artículo presenta un protocolo de aislamiento de membrana plasmática a pequeña escala para la caracterización de la proteína Cdr1 cdr1 de Candida albicans ABC (casete de unión a ATP), sobreexpresada en Saccharomyces cerevisiae. Se diseñó una doble etiqueta mGFPHis C-terminal escindible con una etiqueta doble de 16 residuos entre Cdr1 y la etiqueta para facilitar la purificación y la detección de detergente de Cdr1.
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Artículo de método
Preparación de membrana plasmática a pequeña escala para el análisis de Candida albicans Cdr1-mGFPHis
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Resumen
Resumen
El éxito de la caracterización bioquímica y biofísica de los transportadores ABC depende en gran medida de la elección del sistema de expresión heteróloga. En las últimas dos décadas, hemos desarrollado una plataforma de expresión de proteínas de membrana de levadura que se ha utilizado para estudiar muchas proteínas importantes de membrana fúngica. El huésped de expresión Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ se elimina en siete transportadores ABC endógenos principales y contiene el factor de transcripción Pdr1-3 con una mutación de ganancia de función que permite la sobreexpresión constitutiva de genes de proteínas de membrana heterólogas integradas de manera estable como copias individuales en el locus genómico PDR5. La creación de vectores plásmidos versátiles y la optimización de estrategias de clonación en un solo paso permiten la clonación, mutagénesis y expresión rápidas y precisas de transportadores ABC heterólogos. Aquí, describimos el desarrollo y el uso de una nueva etiqueta doble mGFPHis escindible con proteasa (es decir, la proteína fluorescente verde mejorada con levadura monomérica yEGFP3 fusionada a una etiqueta de purificación de afinidad de seis histidinas) que fue diseñada para evitar la posible interferencia de la etiqueta con la proteína de interés y para aumentar la eficiencia de unión de la etiqueta His a las resinas de afinidad de níquel. La fusión de mGFPHis a la proteína de membrana ORF (marco de lectura abierto) permite una fácil cuantificación de la proteína mediante la inspección de geles de poliacrilamida y la detección de productos de degradación conservando la etiqueta mGFPHis. Demostramos cómo esta característica facilita el cribado con detergente para la solubilización de proteínas de membrana. Se presenta un protocolo para el aislamiento eficiente, rápido y confiable de las preparaciones de membrana plasmática a pequeña escala del transportador de eflujo multifármaco Cdr1 marcado con C-terminalmente marcado como Candida albicans Cdr1 sobreexpresado en S. cerevisiae ADΔΔ. Este protocolo de aislamiento de membranas plasmáticas a pequeña escala genera membranas plasmáticas de alta calidad en un solo día laborable. Las preparaciones de membrana plasmática se pueden utilizar para determinar las actividades enzimáticas de las variantes mutantes Cdr1 y Cdr1.
Introducción
La extracción de proteínas de membrana integral de su entorno lipídico nativo puede afectar dramáticamente su estructura y función1,2,3,4. La compleja composición lipídica de las membranas biológicas5 asegura que puedan ocurrir interacciones proteína-lípido de importancia crítica6. Los lípidos mantienen la integridad estructural de las proteínas de membrana, lo que les permite funcionar correctamente en su(s) destino(s) compartimental(es) de membrana7,
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Protocolo
1. Preparación de existencias frescas o congeladas de células ADΔ y ADΔΔ competentes para la transformación
- Inocular 25 ml de 2x YPCD [es decir, 2x YPD; 2% (p/v) de extracto de levadura, 2% (p/v) de peptona, 4% (p/v) dextrosa), 0,079 % (p/v) CSM (mezcla completa de suplemento)]35 medio con una sola colonia de levadura e incubar durante la noche (o/n) durante 16 h a 30 °C con agitación a 200 revoluciones por minuto (rpm).
- Inocular 225 mL de 2x medio YPCD con el cultivo de 25 mL o/n y comprobar la densidad óptica celular a 600 nm (OD600); el OD600 suele ser ~0.5-1.0.
NOTA: En esta etapa, asegúrese de q....
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Resultados
Se logró una alta frecuencia de transformación de S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x10 4 transformadores/μg) con pYES2(Figura 2B). Como era de esperar, el control sin ADN (es decir, ddH2O solamente) no dio transformadores, y 1 μg del casete de transformación lineal CDR1-mGFPHis (Figura 1A)dio ~ 50 transformadores(Figura 2C)con el protocolo de transformación ADΔΔ optimizado. Los transformadores .......
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Discusión
A pesar del progreso reciente en el análisis estructural de proteínas de membrana, actualmente no se dispone de una estructura 3D para Cdr1, o cualquier otro transportador PDR. Por lo tanto, obtener conocimiento de la estructura de Cdr1 y sus características bioquímicas es importante, ya que esto no solo proporcionará información sobre el diseño racional de nuevos medicamentos para superar la resistencia a los medicamentos mediada por el eflujo, sino también sobre el mecanismo de función de una importante subfamilia de p.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen la financiación del Fondo Marsden de Nueva Zelanda (Subvención UOO1305), y una subvención en bloque de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chulalongkorn, Bangkok, Tailandia (M. Niimi). Desean agradecer a la Universidad de Otago por proporcionar a G. Madani una beca de doctorado. Los autores también desean expresar su gratitud al profesor Stefan Raunser y sus colegas, el Dr. Amir Apelbaum y el Dr. Deivanayagabarathy Vinayagam, por su apoyo y supervisión durante una visita de 6 meses de G. Madani al Instituto Max Planck de Fisiología Molecular (MPIMP), Dortmund, Alemania. Los autores también agradecen al Servicio Alemán de Intercambio Acad....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ácido 2-(N-Morfolino)etano-sulfónico (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| 2-Amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (Tris base; ultrapuro) | Merck | 77-86-1 | |
| 2,2-Didecilpropano-1,3-bis-β-D-maltopirranósido | Anatrace | NG310S | LMNG |
| 2,2-Dihexilpropano-1,3-bis-β-D-glucopiranósido | Anatrace | NG311S | OGNG (MNG-OG) |
| 2,2-Dioctilpropano-1,3-bis-β-D-maltopirranósido | Anatrace | NG322S | DMNG |
| 4-Trans-(4-trans-propilciclohexil)-ciclohexilo &alfa;-D-maltopirranósido | Glycon Biochemicals GmbH | D99019-C | PCC-α-M |
| 40% Acrilamida/Bis-acrilamida (37.5:1) | Bio-Rad | 1610148 | |
| Ácido acético (glacial) | Merck | 64-19-7 | |
| Agar | Formedium | 009002-18-0 | |
| Molibdato de amonio | Sigma-Aldrich | 13106-76-8 | |
| Persulfato de amonio (APS) | Bio-Rad | 1610700 | |
| Sal disódica ATP | Sigma-Aldrich | A-6419 | |
| Azul de bromofenol | SERVA Electroforesis GmbH | 34725-61-6 | |
| CHAPS | Anatrace | C316S | |
| CHAPSO | Anatrace | C317S | |
| CSM | Para medio | DCS0019 | |
| CSM menos uracilo | Para medio | DCS0161 | |
| Ciclohexil-1-butil-β-D-maltopirranósido | Anatrace | C324S | CYMAL-4 |
| Ciclohexilo-1-heptilo-β-D-maltopiranósido | Anatrace | C327S | CYMAL-7 |
| Ciclohexilo-metil-β- D-maltopirranósido | Anatrace | C321S | CYMAL-1 |
| Digitonina | Sigma-Aldrich | 11024-24-1 | |
| Ditiothreitol (DTT) | Roche Diagnostics | 10197785103 | |
| DMSO Merck | 67-68-5 | ||
| Etanol | Merck | 459836 | |
| Etilendiaminotetraacético Ácido disódico sal (EDTA; Titriplex III) | Merck | 6381-92-6 | |
| ExoSAP-IT PCR Reactivo de limpieza de productos | Biosystems aplicado | 78205 | Una mezcla de exonucleasa y fosfatasa |
| Glucosa | Formedium | 50-99-7 | |
| Glicina | |||
| Merck | G8898 | ||
| HEPES | Formedium | 7365-45-9 | |
| Ácido clorhídrico | Merck | 1003172510 | |
| KOD Fx Neo | TOYOBO Co | KFX-201 | Uso para PCR de colonias confiable |
| acetato de litio (LiAc) | Sigma-Aldrich | 546-89-4 | |
| Cloruro de magnesio hexa-hidrato | sigma-Aldrich | M2393 | |
| MES | Formedium | 145224-94-8 | |
| n-decanoil-N-hidroxietil-glucamida | Anatrace | H110S | HEGA-10 |
| n-decanoyl-N-metil-glucamida | Anatrace | M320S | MEGA-10 |
| n-decil-fosfocolina | Anatrace | F304S | Fos-colina-10 |
| n-decil-β-D-maltopirranósido | Anatrace | D322S | DM |
| n-Dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato | Anatrace | AZ312S | Anzergent 3-12 |
| n-dodecil-N,N-dimetilamina-N-óxido | Anatrace | D360S | LDAO |
| n-Dodecil-α-D-maltopirranósido | Anatrace | D310HA | α-DDM |
| n-Dodecil-β-D-maltopirranósido | Anatrace | D310S | β-DDM |
| n-Nonil-β-D-glucopiranósido | Anatrace | N324S | NG |
| n-Nonil-β-D-maltopirranósido | Anatrace | N330S | NM |
| n-Octadecil-N,N-dimetil-3-ammonio-1-propanosulfonato | Anatrace | AZ318S | Anzergent 3-18 |
| n-Octil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato | Anatrace | AZ308S | Anzergent 3-8 |
| n-Octil-fosfocolina | Anatrace | F300S | Fos-colina-8 |
| n-Octilo-β-D-glucopiranósido | Anatrace | O311S | OG |
| n-Tetradecil-fosfocolina | Anatrace | F312S | Fos-colina-14 |
| n-Tetradecilo-β-D-maltopiranósido | Anatrace | T315S | TDM |
| n-Tridecil-fosfocolina | Anatrace | F310S | Fos-colina-13 |
| n-Tridecil-β- D-maltopirranósido | Anatrace | T323S-n-Undecil | |
| -β-D-maltopirranósido | Anatrace | U300S | UM (UDM) |
| n,n,n',n'-tetrametil-etilendiamina (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Octilfenoxipolietoxietanol | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | TRITON X-100 |
| Oligomicina | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Peptona | paramedio | 3049-73-7 | |
| fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) | Roche Diagnostics | 329-98-6 | |
| Phusion Hot Start Flex DNA Polymerasa | New England Biolabs | M0535S | ADN polimerasa de alta fidelidad |
| polietilenglicol (PEG 3350) | Sigma-Aldrich | 25322-68-3 | |
| polioxietilenosmonooleato de orbitán | Sigma-Aldrich | 9005-65-6 | TWEEN 80 |
| Nitrato de potasio | Sigma-Aldrich | P8394 | |
| Kit de ensayo de proteínas | Bio-Rad | 5000122 | Kit de ensayo de proteínas RC DC II |
| QC Tinción coloidal de Coomassie | Bio-Rad | 1610803 | |
| Prisma Escalera de proteínas ultra (10-245 kDa) | Abcam | AB116028 | |
| Azida sódica | Sigma-Aldrich | 71289 | |
| Dodecil sulfato de sodio | Sigma-Aldrich | 151-21-3 | SDS |
| L-ascorbato de sodio BioXtra | Sigma-Aldrich | 11140 | |
| Sacarosa Monododecanoato | Anatrace | S350S | DDS |
| Ácido sulfúrico | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Extracto de levadura | Formedium | 008013-01-2 | |
| Base nitrogenada de levadura sin aminoácidos | Formedium | CYN0402 | |
| Equipo (tipo) | |||
| centrífuga (Eppendorf 5804) | Centrífuga Eppendorf | ||
| (Beckman Ultra) | Beckman | ||
| (Sorvall RC6) | Sorvall | ||
| FSEC (sistema de cromatografía NGC de media presión equipado con un detector de fluorescencia, un muestreador automático, un fraccionador) | Bio-Rad | ||
| Imágenes en gel (GelDoc EZ Imager) | Bio-Rad | ||
| Lector de microplacas (Synergy 2 Multi-Detection) | BioTek Instruments | ||
| (C1000 Touch) | de alimentación Bio-Rad | ||
| (PowerPac) | Bio-Rad | ||
| SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra) | Incubadora de agitación Bio-Rad | ||
| (Multitron) | Infors HT, Bottmingen | ||
| Superose 6 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | GE17-5172-01 | |
| Espectrofotómetro UV/visible (Ultraspec 6300 pro) | Amersham BioSciences UK Ltd |
Referencias
- Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
- Guo, Y. Be cautious with crystal structures of membrane proteins or compl....
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Reimpresiones y permisos
