Producción rápida, asequible y sin complicaciones de lisado bacteriano libre de células

Resumen

Este protocolo describe un método rápido y simple para producir lisado bacteriano para la expresión génica libre de células, utilizando una cepa modificada de Escherichia coli y requiriendo solo equipo de laboratorio estándar.

Resumen

La expresión génica libre de células ofrece el poder de la biología sin las complicaciones de un organismo vivo. Aunque existen muchos de estos sistemas de expresión génica, la mayoría son bastante caros de comprar y / o requieren equipos especiales y experiencia finamente perfeccionada para producir de manera efectiva. Este protocolo describe un método para producir lisado libre de células bacterianas que admite altos niveles de expresión génica, utilizando solo equipos de laboratorio estándar y requiriendo un procesamiento mínimo. El método utiliza una cepa de Escherichia coli que produce una endolisina que no afecta el crecimiento, pero que lisa eficientemente un pellet celular cosechado después de un simple ciclo de congelación-descongelación. El único procesamiento adicional requerido es una breve incubación seguida de centrifugación para limpiar el autolisado de desechos celulares. Los circuitos genéticos dinámicos se pueden lograr a través de la expresión heteróloga de la proteasa ClpX en las células antes de la recolección. Una cepa de E. coli que carece del gen lacZ se puede utilizar para aplicaciones de biodetección de alta sensibilidad y libre de células utilizando una lectura colorimétrica o fluorescente. Todo el protocolo requiere tan solo 8-9 horas, con solo 1-2 horas de trabajo práctico desde la inoculación hasta la finalización. Al reducir el costo y el tiempo para obtener lisado libre de células, este método debería aumentar la asequibilidad de la expresión génica libre de células para diversas aplicaciones.

Introducción

La expresión génica en lisados libres de células tiene varias ventajas sobre el uso de células vivas^1,2,3,4. Los lisados pueden modificarse bioquímicamente fácilmente y usarse en condiciones que podrían ser perjudiciales o imposibles de lograr en células vivas. Los circuitos de expresión génica no tienen que competir con los procesos biológicos del huésped, y probar nuevos circuitos genéticos es tan simple como agregar ADN. Por estas razones, la expresión génica libre de células ha encontrado diversas aplicaciones, desde biosensores

Protocolo

1. Prepare medios y búferes.

1. Preparar el medio 2xYTPG.
   1. Mezcle 62 g de polvo de 2xYT, 5,99 g de fosfato de potasio monobásico, 13,93 g de fosfato de potasio dibásico y agua desionizada a 2 L.
   2. Autoclave en ciclo líquido con un tiempo de exposición de 30 min¹⁴.
   3. A 400 ml de medios 2xYTP de 1.1.2, agregue 7.2 g de D-glucosa (dextrosa) y mezcle hasta que se disuelva.
   4. Filtro-esterilizar a través de un filtro de 0,2 μm.
2. Prepare el búfer de S30A.
   1. Mezcle Tris-HCl (pH 7.7, concentración final de 50 mM), glutamato de potasio (60 mM final) y glutamato de magnesio (14 mM final)....

Resultados

Los resultados representativos se pueden observar mediante el uso de autolisado para expresar GFP a partir de un plásmido que expresa constitutivamente, aquí pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, y registrando un curso de tiempo de fluorescencia de GFP en un lector de placas (Figura 1B). Una serie de dilución de ADN plásmido encontró una fuerte expresión incluso a 1 nM de ADN. En comparación con un lisado disponible comercialmente, el autolisato puede producir un mayor rendimiento total y lograr.......

Discusión

El protocolo descrito aquí produce lisado bacteriano altamente activo para la expresión génica libre de células. La clave es utilizar células portadoras del plásmido pAD-LyseR, que expresa el fago lambda endolisina citosólicamente. Estas células se potencian para lisarse a sí mismas tras la permeabilización de la membrana interna, permitiendo el acceso de la endolisina a la pared celular, lo que el método logra a través de un simple ciclo de congelación-descongelación. Debido a que las células se lisan efectivamente, el .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2xYT medios	EMD Millipore	4.85008	o equivalente
3-PGA	Sigma Aldrich	P8877	o unidad de
filtro centrífugo Amicon Ultra-15 equivalente, corte de 3 kDa	Millipore Sigma	UFC900308	opcional, se puede utilizar para concentrar lisado, seleccione la capacidad del concentrador adecuada para el volumen a concentrar
ampicilina	Sigma Aldrich	A0166-5G	o carbenicilina, una variante más estable
ATP	Sigma Aldrich	A8937	o
equivalente cAMP	Sigma Aldrich	A9501	o equivalente
CoA	Sigma Aldrich	C4282	o equivalente
CTP	United States Biosciences	14121	o
equivalente D-glucosa (dextrosa)	Fisher Scientific	AAA1749603	o equivalente
ditiotreitol (DTT)	Sigma Aldrich	D0632-1G	o
E. coli equivalente BL21-Gold (DE3) portador de pAD-LyseR	Addgene	99244
E. coli BL21-Gold (DE3) y Delta; lacZ portador de pAD-LyseR	Addgene	99245
Ácido folínico	Sigma Aldrich	F7878	o equivalente
GTP	United States Biosciences	16800	o equivalente
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-25G	o medios LB equivalentes
	Fisher Scientific DF0446075		o
glutamato	de magnesio equivalenteSigma Aldrich	49605-250G	o equivalente
NAD	Sigma Aldrich	N6522	o
equivalente glutamato de potasio	Sigma Aldrich	G1501-100G	o equivalente
hidróxido de potasio (KOH)	Sigma Aldrich	221473-25G	para ajustar el pH
fosfato de potasio dibásico	Fisher Scientific	BP363-500	o equivalente
fosfato de potasio monobásico	Fisher Scientific	BP362-500	o equivalente
Espermidina	Sigma Aldrich	85558	o equivalente
Tris-HCl	Fisher Scientific	9310500GM	o mezcla de
ARNt	Roche	10109541001	o equivalente
UTP	United States Biosciences	23160	o equivalente

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