Velkarakteriserte genetiske deler er nødvendige for utformingen av nye genetiske kretser. Her beskriver vi en kostnadseffektiv metode med høy gjennomstrømning for rask karakterisering av genetiske deler. Vår metode reduserer kostnader og tid ved å kombinere cellefrie lysater, lineært DNA for å unngå kloning og akustisk væskehåndtering for å øke gjennomstrømningen og redusere reaksjonsvolumet.
Karakterisering og katalogisering av genetiske deler er avgjørende for utformingen av nyttige genetiske kretser. Å ha godt karakteriserte deler muliggjør finjustering av genetiske kretser, slik at deres funksjon resulterer i forutsigbare utfall. Med veksten av syntetisk biologi som et felt, har det vært en eksplosjon av genetiske kretser som har blitt implementert i mikrober for å utføre funksjoner knyttet til sensing, metabolsk endring og cellulær databehandling. Her viser vi en rask og kostnadseffektiv metode for karakterisering av genetiske deler. Vår metode benytter cellefritt lysat, fremstilt internt som et medium for å evaluere deler via ekspresjonen av et reporterprotein. Mal-DNA fremstilles ved PCR-amplifisering ved hjelp av billige primere for å legge til variantdeler i reportergenet, og malen legges til reaksjonen som lineært DNA uten kloning. Deler som kan legges til på denne måten inkluderer promotorer, operatører, ribosombindingssteder, isolatorer og terminatorer. Denne tilnærmingen, kombinert med inkorporering av en akustisk væskebehandler og 384-brønnplater, tillater brukeren å utføre evalueringer med høy gjennomstrømning av genetiske deler på en enkelt dag. Til sammenligning krever cellebaserte screeningtilnærminger tidkrevende kloning og har lengre testtider på grunn av nattkultur og normaliseringstrinn for kulturtetthet. Videre tillater arbeid i cellefritt lysat brukeren å nøyaktig strammere kontroll over ekspresjonsbetingelsene gjennom tilsetning av eksogene komponenter og DNA ved presise konsentrasjoner. Resultater oppnådd fra cellefri screening kan brukes direkte i applikasjoner av cellefrie systemer eller, i noen tilfeller, som en måte å forutsi funksjon i hele celler.
En kjerneinnsats innen syntetisk biologi er å utvikle genetiske verktøysett som inneholder godt karakteriserte deler, som kan brukes til å konstruere genetiske kretser1 som utfører nyttige funksjoner når de brukes i mikrober eller cellefrie lysater. Områder der slike genetiske kretser har fått trekkraft er sensing 2,3,4, menneskelig ytelse 5,6, biodrivstoff7,8, materialproduksjon 9,10 og cellulær databehandling 11. Registre over standardiserte genetiske deler er etablert12 for å katalogisere nye og eksisterende deler i kategorier som promotorer, operatører, kodesekvenser og terminatorer, for å nevne noen få. Innsats som iGEM (international Genetically Engineered Machines) konkurranse13 har vært medvirkende til å karakterisere og katalogisere disse genetiske delene. Mange metoder er utviklet for å lette rask montering av disse delene i nyttige genetiske kretser14,15. Programvare er til og med utviklet for å automatisere sammensetningen av godt karakteriserte deler i kretser som oppnår en ønsket funksjon16. Samlingen av nyttige genetiske kretser med forutsigbare funksjoner hviler imidlertid på antagelsen om at de genetiske verktøysettene inneholder velkarakteriserte genetiske deler. På grunn av nødvendigheten av disse verktøysettene for å fremme syntetisk biologi, har mange anstrengelser for å bedre katalogisere kretser og deler med passende karakteriseringsdata blitt beskrevet 17,18,19,20,21.
En tilnærming til karakterisering av genetiske komponenter gjør bruk av cellefrie proteinsyntesesystemer (CFPS), som rekonstituerer cellulære funksjoner som transkripsjon og oversettelse ex vivo22. Flere studier har vist potensialet til CFPS for prototyping av genetiske komponenter 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32 enten for direkte applikasjoner i cellefrie systemer eller for å forutsi funksjonen til genetiske konstruksjoner i celler, for eksempel den relative aktiviteten til deler i et bibliotek 29 , optimalisering av metabolsk vei27 og cellulær byrde30. Fordeler med prototyping i CFPS versus celler fremhevet av disse studiene inkluderer å unngå tidkrevende kloning, presis kontroll over konsentrasjonen av DNA og andre reaksjonskomponenter, og muligheten til enkelt å blande og matche flere DNA-konstruksjoner. Fordelen med å unngå kloning er spesielt tydelig når man bruker lineære DNA-maler, som gjør det mulig å sette sammen nye konstruksjoner ved in vitro-metoder som tar timer i stedet for dag33. Evnen til å manipulere konsentrasjonen av DNA-konstruksjoner og andre komponenter ganske enkelt ved pipettering gjør tilnærmingen enda mer attraktiv ved å muliggjøre eksperimentering med høy gjennomstrømning drevet av væskehåndteringsroboter34,35. Mens suksesser som bruker CFPS for prototyping har blitt rapportert, er det viktig å merke seg at det gjenstår å se under hvilke sammenhenger CFPS-resultater pålitelig kan forutsi funksjonalitet i celler.
Her presenterer vi en metode for CFPS-prototyping som understreker fordelene i hastighet, gjennomstrømning og kostnad sammenlignet med tradisjonelle cellebaserte tilnærminger. Tilnærmingen er hentet fra vårt tidligere arbeid der vi brukte CFPS til raskt å karakterisere et bibliotek med T7-promotorvarianter regulert av transkripsjonsfaktoren TetR32, og utvidet betydelig på den lille håndfull regulerte T7-promotorvarianter som var tilgjengelige i litteraturen på den tiden36,37. Andre har siden den gang ytterligere utvidet utvalget av slike promotører38. I vår metode akselereres genetisk konstruksjonsmontering ved å bruke PCR for å amplifisere mal-DNA via primere som legger til variantgenetiske deler til et reportergen. Akustisk væskehåndtering i 384-brønnsplater brukes til å øke gjennomstrømningen og redusere volumet av materialer som kreves. Tidligere arbeid har vist vellykket bruk av akustisk væskehåndtering ved betydelig lavere volumer39,40 med variabilitet sammenlignbar med manuell pipettering av større volumer41. I tillegg til metoden gir vi feilsøkingsinformasjon og en vurdering av potensielle kostnads- og tidsbesparelser. Merk at mens vi inkluderer en protokoll for produksjon av cellefrie lysater basert på Sun et al.42 her, bør mange andre kommersielle sett og protokoller43,44 også fungere. På samme måte, mens vi demonstrerer metoden for karakterisering av promotorvarianter32, kan andre deler byttes ut ved PCR-amplifikasjon, for eksempel riboregulatorer, ribosombindingssteder (RBS), isolatorer, proteinkoder og terminatorer. Vi håper at denne metoden kan hjelpe det syntetiske biologisamfunnet til å fortsette å øke antall karakteriserte deler for montering av forutsigbare genetiske kretser med nyttig funksjon.
Protokollene beskrevet her gir en kostnadseffektiv og rask måte å screene genetiske deler via ekspresjon av et reporterprotein av CFPS. Velkarakteriserte genetiske deler er avgjørende for utformingen av forutsigbare genetiske kretser med nyttig funksjon. Denne metoden øker gjennomstrømningen og reduserer tiden som trengs for å skjerme nye genetiske deler ved å fjerne kravet om å arbeide i levende celler, samtidig som den beholder funksjonalitet som speiler det cellulære miljøet ved å beholde den metabolske prosessen med proteinuttrykk i cellelysatet. Vår protokoll kan utføres på 1 dag etter mottak av primere (~ 2,5-6 timer for reaksjonsforberedelse, 2-16 timer for CFPS-reaksjon; Figur 1), sammenlignet med minst 3 dager for tradisjonell kloning (1 dag hver for konstruksjonsmontering og transformasjon, sekvensverifisering av kloner og dyrking av celler for vurdering). Vi anslår videre at kostnaden per konstruksjon ved bruk av lineært DNA er omtrent en tredjedel av den tradisjonelle kloningen ($ 78 vs. $ 237; Tilleggstabell 1) Metoder. Kommersielle syntesetjenester siterer for tiden minst 4 virkedager, avhengig av størrelse, selv om de vil ha lignende kostnader som vår metode hvis lineære fragmenter screenes direkte i CFPS ($ 78 vs $ 91); Vi har ikke bekreftet denne tilnærmingen. Kostnaden for å evaluere en del med CFPS er liten sammenlignet med genereringen av mal-DNA ($ 0.05 / reaksjon22 vs. $ 78 per mal), selv om det bør bemerkes at oppstartskostnadene for bulkreagenser og lysisutstyr er minst flere tusen dollar. Bruken av en akustisk væskebehandler forbedrer bare kostnadene marginalt ved å muliggjøre mindre volumer ned til 0,5 μL40; Den mer signifikante fordelen er reduksjonen av tiden for å forberede reaksjoner (~ 10 min vs. opptil 1 time, avhengig av antall reaksjoner), spesielt når du forbereder et stort antall reaksjoner, reiser bekymringer for forberedt reaksjon som sitter i lengre tid før inkubasjon.
Selv om det er raskt og kostnadseffektivt, gjenstår det å se begrensningene for når CFPS-prototyping tilstrekkelig forutsier in vivo-funksjon . For eksempel vil ingen kryssreaktivitet med genomisk DNA bli oppdaget på grunn av fjerning av vertsgenomet under produksjonen av CFPS-systemet. Komponentkonsentrasjoner kan også være 1-2 størrelsesordener lavere i CFPS enn i celle51, noe som sannsynligvis vil påvirke oppførselen til enkelte deler som følge av forskjellige makromolekylære trengningsforhold. Videre kan lineært DNAs evne til å forutsi in vivo-funksjon være begrenset, for eksempel når DNA-sekundærstruktur spiller en viktig rolle. En siste begrensning er at konstruksjoner ikke er sekvensverifisert før testing for funksjoner. Det kan være tilfeller der den karakteriserte delen faktisk ikke er i tråd med den tiltenkte teoretiske sekvensen. Alle disse begrensningene kan reduseres ved å validere et delsett av delene som er screenet med denne metoden i den tiltenkte in vivo-applikasjonen .
Vi utviklet opprinnelig denne metodikken for å undersøke effekten av å endre operatørposisjonen på hybride T7-tetO-promotorer 32. Vi har presentert protokollene her i et mer generisk format, slik at de kan brukes på promotorer, operatører, ribosombindingssekvenser, isolatorer og terminatorer. Disse genetiske delene kan legges til 5’eller 3ʹ-enden av reportergenet ved PCR ved hjelp av primere for hvert design, og unngår behovet for syntese eller kloning av hver variant for å teste. De resulterende PCR-produktene fungerer som mal-DNA for evaluering via ekspresjonen av et reporterprotein. I vårt arbeid ble affinitetsrensingsprotokollen gitt her brukt for TetR og GamS. Den samme prosedyren kan brukes til ekspresjon og rensing av andre repressorer, aktivatorer, polymeraser, sigmafaktorer og andre proteiner som er kognitive til en genetisk del av interesse, selv om modifikasjoner kan være nødvendig for det ønskede proteinet som uttrykkes. Rensing og titrering av disse proteinene i CFPS-reaksjoner muliggjør en mer detaljert karakterisering av en bestemt genetisk del. Endelig finnes det mange alternative CFPS-protokoller, og hver bør være mottagelig for delscreeningsdelen av metodikken. Som et eksempel inkluderer vi ikke et dialysetrinn i denne protokollen, som andre har funnet å være viktig for uttrykk fra innfødte bakterielle promotorer22. Det er også mulig å variere konsentrasjonene av underliggende bestanddeler i CFPS. Bruken av væskehåndtering forbedrer evnen til å teste de utallige forholdene ved å øke gjennomstrømningen og redusere materialene som kreves34,35.
Et område som kan kreve betydelig feilsøking er optimalisering av den akustiske væskebehandleren. Dispensering av akustisk væskehåndtering bør optimaliseres for hver komponent som overføres, og det anbefales på det sterkeste å kjøre kontroller for å verifisere riktig distribusjon og reproduserbarhet før data samles inn. Den ideelle innstillingen for kildeplatetype og væskeklasse vil avhenge av den spesifikke væsken som skal dispenseres og dens komponenter. Det anbefales ikke å bruke aminbelagte plater for å dispensere DNA, da aminbelegget kan interagere med DNA. Det skal også bemerkes at evnen til å dispensere høyere konsentrasjoner av visse komponenter kan avhenge av den akustiske væskehåndteringsmodellen. En test væskeoverføring kan utføres ved å dispensere på en folieplateforsegling for å visualisere vellykket dråpedannelse; Denne testen gir imidlertid begrenset informasjon, og slippverktøy fra forskjellige innstillinger kan virke identiske. Bruk av et vannløselig fargestoff, slik som tartrazin, kan brukes til å mer nøyaktig verifisere at riktig volum dispenseres med en gitt innstilling eller arbeidsflyt (se Representative resultater). Optimal programmering av væskeoverføringer kan også påvirke nøyaktigheten og konsistensen av data som genereres; For overføringer >1 μL fra en kildebrønn til en destinasjonsbrønn har vi funnet at sekvensielle overføringer på ≤1 μL bør programmeres for å redusere systematisk variasjon fra brønn til brønn (figur 4). Til slutt kan teoretiske og faktiske kildebrønndøde volumer variere dramatisk avhengig av kildeplatetype, væskeklasseinnstilling og komponenter i den spesifikke væsken; Bruk av undersøkelsesfunksjonen for akustisk væskehåndtering for å vurdere brønnvolumene før et program kjøres, kan bidra til å måle hvor nøyaktig instrumentet er i stand til å måle en bestemt væske.
CFPS-reaksjonsytelsen kan variere når man sammenligner resultater mellom forskjellige brukere, partier av materialer, platelesere og laboratorier41. For tilfeller der slike sammenligninger kreves under prototyping av genetiske kretser, anbefaler vi å inkludere interne kontrollreaksjoner med standard konstitutive promotorer i hver reaksjonsplate for å bidra til å normalisere resultatene på tvers av eksperimentelle oppsett. Metoden for DNA-forberedelse kan også bidra vesentlig til CFPS-aktivitet; Inkludering av et etanolutfellingstrinn anbefales. I tillegg kan den optimale reaksjonssammensetningen variere ved batchen av ekstrakt34. Spesielt optimale magnesiumglutamat- og kaliumglutamatkonsentrasjoner har vist seg å variere etter batch42 eller med promotor- eller reporterproteinet som brukes24. Konsentrasjoner av disse komponentene bør optimaliseres ved screening over flere konsentrasjoner av hver komponent per genetisk konstruksjon og per celleekstraktpreparat for å bestemme de optimale forholdene for proteinuttrykk. Til slutt inkluderer beste praksis for konsistent CFPS-reaksjonsytelse grundig blanding, forsiktig pipettering og konsistens i fremstillingen av hver reagenskomponent.
Utover karakterisering av individuelle deler, kan samme metode brukes til å skjerme kombinasjoner av deler som danner komplekse kretser, for eksempel logiske kretser16 eller oscillatorer52,53. Denne metoden kan også brukes til screening og optimalisering av biosensorer for applikasjoner i epidemiologisk diagnostikk 54,55,56,57 eller faredeteksjon og kvantifisering 3,58,59. Anvendelsen av AI-drevne teknikker som aktiv læring34 kan også kobles sammen med den høye gjennomstrømningen til denne metoden for å drive rask utforskning av komplekse biologiske designrom. Til syvende og sist ser vi for oss at denne tilnærmingen støtter akselererte utviklingstider for nye genetiske design innen syntetisk biologi.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble gjort mulig av Office of the Secretary of Defense’s Applied Research for the Advancement of Science and Technology Priorities-programmet. Vi takker Scott Walper (Naval Research Laboratory) for å levere lageret av sfGFP som brukes, og Zachary Sun og Abel Chiao (Tierra Biosciences) for fruktbare diskusjoner knyttet til prototyping med cellefrie systemer og relatert feilsøking av akustisk væskehåndtering.
2x YT medium | Sigma-Aldrich | Y2377-250G | Alternative to making 2xYT media |
Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | S30 Buffer B |
Agar | Bacto | 214010 | For plating cells |
Chromatography column (5 cm diameter) | BIO-RAD | 731-1550 | Used for protein purification. |
Destination plate | Thermo Scientific Nunc plate | 142761 | For CFPS reactions |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | For dialysis buffer |
DpnI | NEB | R0176L | For digestion of plasmid templates |
DTT | Roche | 20871723 | S30 Buffer B |
E. coli BL21(DE3) Rosetta2 | Novagen | 70954 | Cell line used for production of lysate and purified proteins |
Echo acoustic liquid handler | Labcyte | 525 | Acoustic liquid handler |
French pressure cell | Thermo Spectronic | FA-078 | For lysing cells for CFPS |
Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750 | For buffers |
Impermeable plastic sealable lid | Thermo | 232702 | Plate seal |
IPTG | RPI | I56000-25.0 | Used for protein induction. |
K-Glu | Sigma-Aldrich | g1501-500G | S30 Buffer B |
Labcyte Echo source plate | Labcyte | PL-05525 | For use with Echo acoustic liquid handler |
Mg-Glu | Sigma-Aldrich | 49605-250G | S30 Buffer B |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-250G | For buffers |
NaHPO4 | Sigma-Aldrich | 71505 | For dialysis buffer |
NaOH | Mallinckrodt Chemicals | 7708-10 | For making 2xYT media. Currently not produced by Mallinckrodt. Alternate: Sigma-Aldrich S0899 |
Ni-NTA resin | Invitrogen | R901-15 | For production of purified proteins |
PCR H2O | Ambion | AM9937 | PCR of linear templates |
Plate Reader | BioTek | H10 | Plate reader used |
Q5 PCR Master Mix | NEB | M0494S | PCR of linear templates |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28606 | PCR of linear templates |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR of linear templates |
QSonica Ultrasonic Processor | Qsonica | Q700 | Cell disruption during protein purification |
RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | Updated supplier from Sun et al. |
Tris | MP | 819623 | S30 Buffer B |
Tris-Cl | Sigma-Aldrich | T5941 | For buffers |
Tryptone | Fluka | T7293 | For making 2xYT media |
Yeast Extract | Bacto | 212750 | For making 2xYT media |