Este protocolo presenta un ensayo de captación de aminoácidos radiomarcado, que es útil para evaluar el consumo de aminoácidos en células primarias o en huesos aislados.
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Artículo de método
Evaluación del consumo de aminoácidos en células óseas cultivadas y tallos óseos aislados
En este artículo
Resumen
Resumen
El desarrollo óseo y la homeostasis dependen de la diferenciación y la actividad de los osteoblastos formadores de hueso. La diferenciación de osteoblastos se caracteriza secuencialmente por la proliferación seguida de la síntesis de proteínas y, en última instancia, la secreción de la matriz ósea. La proliferación y la síntesis de proteínas requieren un suministro constante de aminoácidos. A pesar de esto, se sabe muy poco sobre el consumo de aminoácidos en los osteoblastos. Aquí describimos un protocolo muy sensible que está diseñado para medir el consumo de aminoácidos utilizando aminoácidos radiomarcados. Este método está optimizado para cuantificar los cambios en la absorción de aminoácidos que están asociados con la proliferación o diferenciación de osteoblastos, tratamientos con medicamentos o factores de crecimiento, o diversas manipulaciones genéticas. Es importante destacar que este método se puede utilizar indistintamente para cuantificar el consumo de aminoácidos en líneas celulares cultivadas o células primarias in vitro o en ejes óseos aislados ex vivo. Finalmente, nuestro método se puede adaptar fácilmente para medir el transporte de cualquiera de los aminoácidos, así como la glucosa y otros nutrientes radiomarcados.
Introducción
Los aminoácidos son compuestos orgánicos que contienen un grupo funcional amino (-NH2) y carboxilo (-COOH) con una cadena lateral variable que es específica para cada aminoácido. En general, los aminoácidos son bien conocidos como el constituyente básico de la proteína. Más recientemente, se han dilucidado nuevos usos y funciones de los aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos individuales pueden metabolizarse para generar metabolitos intermedios que contribuyen a la bioenergética, funcionan como cofactores enzimáticos, regulan las especies reactivas de oxígeno o se utilizan para sintetizar otros aminoácidos 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10
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Protocolo
Todos los procedimientos con ratones descritos en este documento fueron aprobados por los Comités de Estudios Animales del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas en Dallas. El protocolo de radiación fue aprobado por el Comité Asesor de Seguridad Radiológica del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas en Dallas.
1. Captación de aminoácidos en las células (Protocolo I)
- Placa 5 x 104 células ST2 en cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos. Células en placa en α-MEM que contienen 10% de FBS, 100 U/ml de penicilina y 0,1 μg/ml de estreptomicina (Pen/Strep). C....
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Resultados
El transporte de aminoácidos está regulado por muchos transportadores de aminoácidos unidos a la membrana que han sido categorizados en distintos sistemas de transporte basados en numerosas características, incluyendo la especificidad del sustrato, la cinética, así como la dependencia de iones y pH25. Por ejemplo, la absorción de glutamina puede estar mediada por los sistemas de transporte dependientes de Na+ A, ASC, γ+L y N o el Sistema L independiente de Na+. Los sistemas d.......
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Discusión
El protocolo descrito en este documento proporciona un enfoque rápido y sensible para evaluar la absorción de aminoácidos en respuesta a diversas permutaciones experimentales, ya sea in vitro o ex vivo. En comparación con los kits disponibles comercialmente (por ejemplo, el kit de determinación de glutamina y glutamato), este método es mucho más sensible, más rápido y menos laborioso16,17,25. En nuestro protoco.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen revelaciones.
Agradecimientos
El laboratorio Karner cuenta con el apoyo de subvenciones R01 del Instituto Nacional de Salud (AR076325 y AR071967) a C.M.K.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,25% tripsina | Gibco | 25200 | |
| Placa de 12 pocillos | Corning | 3513 | |
| 1 mL Jeringa | BD precisión | 309628 | |
| 30G Aguja | BD precisión | 305106 | |
| Arginina Monoclorhidrato L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 contador de centelleo | |||
| Cloruro de calcio | Sigma | C1016 | |
| Cloruro de colina | Sigma | C7077 | |
| D-(+)-Solución de glucosa | Sigma | G8769 | |
| Herramienta | Pinzas, tijeras, cajillas | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Glutamina | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Solución de cloruro de litio, 8M | Sigma | L7026 | |
| Cloruro de magnesio | Sigma | M8266 | |
| Gibco | 12561 | ||
| Tubo de microcentrífuga, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| Cloruro de potasio | Sigma | P3911 | |
| Bicarbonato de sodio | Sigma | S6014 | |
| Cloruro de sodio | Sigma | S9888 | |
| Desoxicolato de sodio | Sigma | D6750 | |
| Dodecil sulfato de sodio | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic& Materiales | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma 648311 | ||
| Ultima Gold (Solución de centelleo) | PerkinElmer | 6013329 | |
| α-(Metilamino)ácido isobutírico | Sigma | M2383 |
Referencias
- Xiao, M., et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).
- Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V.
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Reimpresiones y permisos
