La cirugía estereotáxica para atacar los sitios cerebrales en ratones comúnmente implica el acceso a través de los huesos del cráneo y es guiada por puntos de referencia del cráneo. Aquí describimos un enfoque estereotáxico alternativo para apuntar al tronco encefálico caudal y la médula espinal cervical superior a través de la cisterna magna que se basa en la visualización directa de los puntos de referencia del tronco encefálico.
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Artículo de método
Abordaje quirúrgico estereotáxico para microinyectar el tronco encefálico caudal y la médula espinal cervical superior a través de la Cisterna Magna en ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
La cirugía estereotáxica para atacar los sitios cerebrales en ratones es comúnmente guiada por puntos de referencia del cráneo. El acceso se obtiene a través de agujeros de rebaba perforados a través del cráneo. Este enfoque estándar puede ser un desafío para los objetivos en el tronco encefálico caudal y la médula cervical superior debido a desafíos anatómicos específicos, ya que estos sitios están alejados de los puntos de referencia del cráneo, lo que lleva a la imprecisión. Aquí describimos un enfoque estereotáxico alternativo a través de la cisterna magna que se ha utilizado para apuntar a regiones discretas de interés en el tronco encefálico caudal y el cordón cervical superior. La cisterna magna se extiende desde el hueso occipital hasta el atlas (es decir, el segundo hueso vertebral), está llena de líquido cefalorraquídeo y está cubierta por duramadre. Este enfoque proporciona una ruta de acceso reproducible a estructuras seleccionadas del sistema nervioso central (SNC) que de otro modo serían difíciles de alcanzar debido a las barreras anatómicas. Además, permite la visualización directa de puntos de referencia del tronco encefálico muy cerca de los sitios objetivo, lo que aumenta la precisión al administrar pequeños volúmenes de inyección a regiones restringidas de interés en el tronco encefálico caudal y el cordón cervical superior. Finalmente, este enfoque brinda la oportunidad de evitar el cerebelo, que puede ser importante para los estudios motores y sensoriomotores.
Introducción
La cirugía estereotáxica estándar para atacar los sitios cerebrales en ratones1 comúnmente implica la fijación del cráneo utilizando un conjunto de barras para los oídos y una barra bucal. Las coordenadas se estiman entonces en función de los atlas de referencia 2,3 y los puntos de referencia del cráneo, a saber, bregma (el punto donde se unen las suturas de los huesos frontal y parietal) o lambda (el punto donde se unen las suturas de los huesos parietal y occipital; Figura 1A,B). A través de un orificio de rebaba en el cráneo por encima d....
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Protocolo
El autor declara que el protocolo sigue las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Centro Médico Beth Israel Deaconess.
1. Preparación de instrumentos quirúrgicos y marco estereotáxico
NOTA: La cirugía se realiza en condiciones asépticas. La esterilidad se mantiene mediante la técnica de punta estéril.
- Instale el brazo estereotáxico con una micropipeta o jeringa llena de un inyectable de su elección (virus adenoasociado (AAV) o trazador convencional) en el marco estereotáxico y prepare el adaptador de ratón (Figura 2A). ....
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Resultados
El enfoque cisterna magna permite apuntar a las estructuras del tronco encefálico caudal y del cordón cervical superior que de otro modo serían difíciles de alcanzar a través de enfoques estereotáxicos estándar o que son propensas a una orientación inconsistente. La cirugía para llegar a la cisterna magna requiere incisiones de la piel, una capa delgada de músculo trapecio y la abertura de la duramadre y, por lo tanto, es bien tolerada por los ratones. Es especialmente eficiente y menos invasivo cuando se dirige.......
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Discusión
La cirugía estereotáxica estándar comúnmente se basa en puntos de referencia del cráneo para calcular las coordenadas de los sitios objetivo en el SNC1. Luego se accede a los sitios objetivo a través de orificios de rebaba que se perforan a través del cráneo1. Este método no es ideal para el tronco encefálico caudal, ya que los sitios objetivo se encuentran distantes de los puntos de referencia del cráneo en los planos anteroposterior y dorsoventral
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por R01 NS079623, P01 HL149630 y P01 HL095491.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Almohadilla con alcohol | Med-Vet International | SKU: MDS090735Z | preparación de la piel para la prevención de infecciones del sitio quirúrgico |
| Pinzas en ángulo, Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | solo para agarrar dura |
| Almohadilla Betadine | Med-Vet International | SKU:PVP-pad | Preparación de la piel para la prevención de infecciones del sitio quirúrgico |
| Toxina del cólera subunidad-b, Alexa Fluor 488/594 conjugado | Thermo Fisher Scientific | 488: C34775, 594: C22842 | Cortaúñas trazadoras fluorescentes |
| Wahl | modelo MC3, 28915-10 | para el afeitado de pieles en el sitio quirúrgico | |
| Portaelectrodos con abrazadera de esquina | Kopf | 1770 | para sujetar la pipeta de vidrio |
| Caudalímetro | Gilmont instruments | modelo # 65 MM | para regular el flujo de isoflurano y oxígeno al ratón en el plano quirúrgico |
| Microesferas fluorescentes de poliestireno | Thermo Fisher Scientific | F13080 | Trazador fluorescente |
| Almohadilla térmica | Stoelting | 53800M | termorregulación |
| Cámara de inducción con kit de conexión de puerto | Midmark Inc | de 93805107 92800131 | que proporciona anestesia inicial |
| Jeringa de insulina | Exelint International | 26028 | para administrar solución salina y analgésico |
| Isoflurano | Med-Vet International | SKU:RXISO-250 | anestésico inhalante |
| Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizador | Midmark Inc | 91305430 | aparato para la administración de anestésico inhalante |
| Pinzas de laminectomía, Dumont #2 | FST | 11223-20 | solo para limpiar dura |
| Aire medicinal, comprimido | Linde | UN 1002 | Se utiliza con estimulador & PicoPump para el suministro de aire para la inyección de solución de precisión |
| Meloxicam SR | Zoo Pharm LLC | Lote # MSR2-211201 | analgésico |
| Microhematocrito vidrio de borosilicato tubo capilar precalibrado | Globe Scientific Inc | 51628 | para la transfección de material a coordenadas designadas |
| Adaptador de ratón | Stoelting | 0051625 | Adaptación del marco estereotáxico de rata para la cirugía de ratones |
| Portaagujas, Student Halsted- Hemostáticos para mosquitos | FST | 91308-12 | para suturar |
| Regulador de oxígeno | Productos de soporte vital | S/N 909328, lote 092109 | regular los niveles de oxígeno del tanque de oxígeno |
| Tanque de oxígeno, comprimido | Linde | USP UN 1072 | suministrado junto con anestesia de isoflurano |
| Tarjeta de plástico | no aplicable | no aplicable | cualquier tarjeta de plástico firme, cortada para adaptarse al marco estereotáctico (por ejemplo, tarjeta de identificación) |
| PicoPump neumática ( o similar) | World Precision Instruments (WPI) | SYS-PV820 | Para inyección de solución de precisión |
| Solución salina, estéril | Mountainside Medical Equipment | H04888-10 | para reemplazar los fluidos corporales perdidos durante la cirugía |
| Mango de bisturí, #3 | FST | 10003-12 | para bisturí de sujeción |
| Tijeras, Wagner | FST | 14070-12 | para cortar sutura de polipropileno |
| Tijeras de resorte, Vannas 2,5 mm con caja adjunta | FST | 15002-08 | tijeras solo para abrir duramadre, caja para elevar el cuerpo |
| Micromanipulador estereotáctico | Kopf | 1760-61 | conectado al portaelectrodos para ajustar la posición en función de las |
| coordenadasConjunto de bastidor estereotáctico en "U" y placa base intracelular | Kopf | 1730-B, 1711 | marco para cirugía |
| Aplicadores estériles con punta de algodón | Puritan | 25-806 10WC | que absorben la sangre del campo quirúrgico |
| Paños estériles no fenestrados | Henry Schein | 9004686 | para el campo quirúrgico estéril |
| Pomada oftálmica estéril | Puralube | P1490 | ocular lubricante |
| Estimulador & Tubo | Grass Medical Instruments | S44 | para proporcionar aire presurado controlado para la inyección de solución de precisión |
| Cuchilla quirúrgica #10 | Med-Vet International | SKU: 10SS | para incisión en la piel |
| Pinzas quirúrgicas extrafinas Graefe | FST | 11153-10 | para sujetar la piel |
| Guantes quirúrgicos | Med-Vet International | MSG2280Z | para cirugía |
| acépticaMicroscopio quirúrgico | Leica | modelo M320/ F12 | para un aumento de 5X-40X del sitio quirúrgico |
| Sutura 5-0 polipropileno | Oasis | MV-8661 | para cerrar la piel |
| Tegaderm | 3M | 3M ID 70200749250 | proporciona barrera estéril |
| Abrazadera universal y poste de soporte | Kopf | 1725 | unido al marco estereotáctico en U y placa base intracelular |
| Gancho para heridas con Hemostáticos hartman | FST | 18200-09, 13003-10 | para separar los músculos y proporcionar una ventana quirúrgica |
Referencias
- JoVE. Rodent Stereotaxic Surgery. JoVE Science Education Database. , Neuroscience (2021).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2001).
- Lein, E. S., et al.
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Reimpresiones y permisos
