Preparación y caracterización de biotinta de hidrogel biohíbrida 3D basada en grafeno para neuroingeniería periférica

Summary

En este manuscrito, demostramos la preparación de una biotinta de hidrogel biohíbrida que contiene grafeno para su uso en ingeniería de tejidos periféricos. Utilizando este material biohíbrido 3D, se realiza el protocolo de diferenciación neural de las células madre. Este puede ser un paso importante para traer biomateriales similares a la clínica.

Abstract

Las neuropatías periféricas pueden ocurrir como resultado del daño axonal, y ocasionalmente debido a enfermedades desmielinizantes. El daño a los nervios periféricos es un problema global que ocurre en el 1.5% -5% de los pacientes de emergencia y puede conducir a pérdidas significativas de empleos. Hoy en día, los enfoques basados en la ingeniería de tejidos, que consisten en andamios, líneas celulares apropiadas y bioseñales, se han vuelto más aplicables con el desarrollo de tecnologías de bioimpresión tridimensional (3D). La combinación de varios biomateriales de hidrogel con células madre, exosomas o moléculas de bioseñalización se estudia con frecuencia para superar los problemas existentes en la regeneración de nervios periféricos. En consecuencia, la producción de sistemas inyectables, como hidrogeles, o estructuras de conductos implantables formados por diversos métodos de bioimpresión ha ganado importancia en la neuroingeniería periférica. En condiciones normales, las células madre son las células regenerativas del cuerpo, y su número y funciones no disminuyen con el tiempo para proteger a sus poblaciones; Estas no son células especializadas, pero pueden diferenciarse con la estimulación adecuada en respuesta a una lesión. El sistema de células madre está bajo la influencia de su microambiente, llamado nicho de células madre. En las lesiones de los nervios periféricos, especialmente en la neurotmesis, este microambiente no se puede rescatar por completo incluso después de unir quirúrgicamente las terminaciones nerviosas cortadas. El enfoque de biomateriales compuestos y terapias celulares combinadas aumenta la funcionalidad y aplicabilidad de los materiales en términos de diversas propiedades, como la biodegradabilidad, la biocompatibilidad y la procesabilidad. En consecuencia, este estudio tiene como objetivo demostrar la preparación y el uso de patrones de hidrogel biohíbridos basados en grafeno y examinar la eficiencia de diferenciación de las células madre en células nerviosas, que pueden ser una solución efectiva en la regeneración nerviosa.

Introduction

El sistema nervioso, que es el mecanismo que une la estructura interna del organismo y el medio ambiente, se divide en dos partes: el sistema nervioso central y periférico. El daño a los nervios periféricos es un problema global que constituye el 1,5%-5% de los pacientes que acuden al servicio de urgencias y se desarrolla debido a diversos traumatismos, lo que lleva a una pérdida significativa del empleo ^1,2,3.

Hoy en día, los enfoques celulares de la neuroingeniería periférica son de gran interés. Las células madre ocupan el primer lugar entre las....

Protocol

1. Cultivo de células madre mesenquimales gelatinosas de Wharton

1. Tome las células madre mesenquimales gelatinosas de Wharton (WJ-MSC, de ATCC) de un congelador de -80 °C. Cultivo de WJ-MSCs en medio DMEM-F12 que contiene 10% de suero fetal de ternera (FBS), 1% de Pen-Strep y 1% de L-glutamina en un flujo laminar estéril a temperatura ambiente, como se describe en Yurie et ^al.20.
2. Criopreservar algunas de las células a 1 x 10⁶ células/ml con medio de congelación que contiene 35% FBS, 55% DMEMF-12 y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Para esto, cuente 1 x 10⁶ celdas en un portaobjetos de cont....

Results

Toxicidad del grafeno e imágenes 2D
El análisis estadístico de los resultados MTT obtenidos se realizó con un ANOVA unidireccional con la prueba de Tukey en software de análisis estadístico, y el gráfico obtenido se muestra en la Figura 2. El porcentaje de grafeno en comparación con el control mostró una disminución significativa solo para la concentración de grafeno al 0,001% (**p < 0,01). No hubo diferencias significativas entre los otros grupos y el control (p > .......

Discussion

Las ventajas de los tratamientos aplicados con andamios 3D diseñados sobre los métodos 2D convencionales son cada vez más notables cada día. Las células madre utilizadas solas en estas terapias o junto con andamios producidos a partir de diversos biomateriales con baja biocompatibilidad y biodegradabilidad suelen ser inadecuadas en la regeneración de los nervios periféricos. Las células madre mesenquimales gelatinosas de Wharton (WJ-MSCs) parecen ser una línea celular candidata adecuada, especialmente considerando la opt.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrífuga	Hitachi		Utilizada en cultivo celular y biomaterial paso
0.1N CaCl2	HD Bioink		Utilizada para reticulante
0.22 y micro; m filtro de membrana	Aι SΙ mo		Se utiliza para la esterilización
0.45 y micro; m filtro de jeringa	Aι SΙ mo		Se utiliza para la esterilización
Tubo cónico de 1,5 ml	Eppendorfa	Se utiliza para la gota
15 ml Tubo de halcón	Nido		Utilizado en el paso de cultivo celular
Matraces de cultivo celular de 25 cm2 (Halcón, Matraces de cultivo de tejidos TPP	Nido		Utilizado para cultivo celular
Bioimpresión 3D	Axolotl Biosystems Bio A2 (Turquía)		Paso
de bioimpresión50 mL Falcon tube	Nest		Utilizado en el paso de cultivo celular
6/24/48/96 placas de pocillos (Falcon, microplacas TPP)	Merck Millipore		Utilizado en el paso de cultivo celular
Matraces de cultivo celular de 75 cm2 (Falcon, TPP matraces de cultivo de tejidos	Nest		Utilizado para el cultivo celular
Anti ratón IgG-FTIC-conejo	Santa Cruz Biotechnology	J1514	Anticuerpo secundante, utilizado para el tinte
Anti ratón IgG-SC2781-cabra	Santa Cruz Biotechnology	C3109	Anticuerpo secundado, utilizado para
dispositivo de recubrimiento de tinte Au EM ACE600	Leica		para el chapado en oro de la sección de biomaterial antes de la imagen SEM
Autoclave	NUVE-OT 90L		Utilizado para el proceso de esterilización.
Autoclave	NUVE-OT 90L		Se utiliza para el proceso de esterilización.
Cell Cultre Cabine	Hera Safe KS	Utilizado para el proceso
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12	Sigma	RNBJ7249	Utilizado como medio de cultivo celular
FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM	Quanta	FEG 450	para SEM
Suero fetal bovino-FBS	Capricornio	FBS-16A	Se utilizó añadiéndolo al medio de cultivo celular.
Congelador -80 grados; C	Panasonic	MDF-U5386S-PE	Nos utilizamos para almacenar células y los exosomas resultantes
Gelatina-Alginato biotinta	en polvo HD Bioink		Utilizado para la producción de biotinta paso
GFP etiquetado-WJ-MSCs	Virostem		Utilizado para la obtención de imágenes a la interacción célula-biotinta
Nanoplaquetas de grafeno (Grafeno-IGP2)	Grafen Chemical Industries Co.		Utilizado para la producción de biotinta 3D-G
Anticuerpos de inmunofluorescencia (N-CAD; β-III Tubulina)	Señalización celular y Santa Cruz		Utilizado para colorante
JASCO 6600	Tetra		para ensayo FTIR
MTT Pruebas	Sigma		Solución
penicilina/estreptomicina	Capricornio	PB-S	Se añadió al medio para evitar la contaminación en cultivo celular.
Thoma portaobjetos	Isolab		Se utiliza para el recuento de células
Sistema de imagen Time-Lapse	Zeiss Axio.Observer.Z1		Imaging
Tripsin-EDTA	Multicell		El matraz se utilizó para eliminar las células que cubrían la superficie.
Vorteks	Biobase		Para la producción de biotinta paso
WJ-MSC	ATCC		Se utiliza para el proceso de cultivo celular