Summary

Geração de Células-Tronco Mesenquimal do Tecido do Cordão Umbilical Humano e sua Diferenciação na Linhagem Muscular Esquelética

Published: August 31, 2022
doi:

Summary

Descrevemos um protocolo para o isolamento das células-tronco mesenquimais do tecido do cordão umbilical humano e sua diferenciação na linhagem muscular esquelética.

Abstract

Explorar o potencial terapêutico das células-tronco mesenquimais depende da facilidade de isolamento, potência em direção à diferenciação e confiabilidade e robustez da fonte. Descrevemos aqui um protocolo stepwise para o isolamento de células-tronco mesenquimais do tecido do cordão umbilical humano (uMSCs), sua imunofenofoteca, e a propagação de tais culturas ao longo de várias passagens. Neste procedimento, a viabilidade dos MOSCs é alta porque não há digestão enzimática. Além disso, a remoção dos vasos sanguíneos, incluindo as artérias do cordão umbilical e a veia, garante que não haja contaminação de células de origem endotelial. Usando citometria de fluxo, os uMSCs no isolamento são CD45-CD34, indicando ausência de células da linhagem hematopoiética. É importante ressaltar que eles expressam marcadores de superfície chave, CD105, CD90 e CD73. Após o estabelecimento de culturas, este artigo descreve um método eficiente para induzir a diferenciação nesses FUSÕES na linhagem muscular esquelética. Uma análise detalhada da progressão miogênica em uMSCs diferenciados revela que os uMSCs expressam Pax7, um marcador para progenitores miogênicos nos estágios iniciais de diferenciação, seguido pela expressão de MyoD e Myf5, e, finalmente, um marcador de diferenciação terminal, cadeia pesada de miosina (MyHC).

Introduction

O cordão umbilical humano foi creditado por possuir um robusto reservatório de células-tronco mesenquimais, que atualmente estão sendo exploradas para terapias regenerativas devido às suas robustas taxas de proliferação e diferenciação, propriedades imunomodulatórias e capacidade de gerar células de todas as três camadas germinativas1. O tecido do cordão umbilical consiste em múltiplos compartimentos, como o sangue do cordão umbilical, o subendotélio da veia umbilical e a geleia de Wharton (WJ), que por si só abrange três regiões indistintas – a zona perivascular, a zona intervascular e o subameamento ou o revestimento do cordão (CL)2. Embora os MSCs possam ser isolados de todas essas diferentes regiões e expressem amplamente os principais marcadores MSC, não há clareza sobre se esses compartimentos contêm a mesma população de uMSCs ou apresentam diferenças em suas potências de diferenciação3. Assim, os protocolos para o isolamento dos UMSCs requerem maior precisão em seu modo e região de isolamento, a caracterização robusta de potenciais de diferenciação e, finalmente, uma análise comparativa de diferentes compartimentos do cabo.

Nesse contexto, poucos estudos demonstraram diferenças nos potenciais proliferativos e diferenciais do UMSC entre diferentes partes do cabo. Destes, análises comparativas entre os RCSS isolados das regiões cl e WJ revelaram maior potencial de proliferação em UMSCsderivados da CL 3,4. Em um estudo separado, os UMSCs derivados do WJ tiveram melhor desempenho em ensaios de proliferação em comparação com células perivasculares (HUCPV)5. Ao examinar diferenças entre os UMSCs derivados do sangue do cordão e os UMSCs derivados do tecido do cordão desprovidos de contaminação vascular, foi relatada expressão diferencial dos principais marcadores MSC entre os dois compartimentos, bem como o aumento das taxas de proliferação nos UMSCs derivados do tecido do cordão6.

Dos diversos estudos que examinam os potenciais de diferenciação dos MICOSCs principalmente em tecidos da linhagem de mesoderm, como linhagenia, adipogênica e linhagenia, muito poucos forneceram protocolos detalhados para diferenciação miogênica e caracterização subsequente, bem como análises comparativas entre vários compartimentos de cordão. Neste contexto, desenvolvemos um robusto protocolo de diferenciação muscular e observamos que os uMSCs derivados do tecido do cordão apresentam capacidades de diferenciação miogênica superiores em comparação com o sangue do cordãoumbilical 6. Aqui, um protocolo stepwise é detalhado para o isolamento de uMSCs de todo o tecido do cordão umbilical desprovido de células associadas à vasculatura, sua caracterização e sua diferenciação na linhagem miogênica.

Protocol

O uso de tecido do cordão umbilical neste estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Pesquisa de Células-Tronco (IC-SCR), pelo Comitê de Ética Institucional, Instituto Translacional de Ciência e Tecnologia em Saúde (IEC-THSTI), pelo Comitê de Ética Institucional do Hospital Civil, Gurugram, Haryana e pelo Comitê de Biossegurança Institucional, THSTI. Amostras de tecido do cordão humano foram colhidas a partir de partos a termo no momento do nascimento. O consentimento por escrito informado foi obtido do…

Representative Results

O sucesso do isolamento dos UMSCs do tecido do cordão umbilical é >95%, ao contrário das baixas taxas de sucesso do sangue do cordão umbilical. Após o isolamento bem-sucedido dos uMSCs, a análise facs revela que todas as células são CD34−CD45−CD105+CD90+. No entanto, na análise comparativa, os ICSS isolados do sangue do cordão umbilical apresentam populações heterogêneas, em que uma proporção de células mostram CD34+CD45+CD105+</su…

Discussion

Passos críticos
Um passo crítico neste protocolo é a coleta de tecido em condições assépticas, desde o momento da entrega até a manutenção de culturas estéreis, durante toda a duração da propagação. Durante a coleta do cabo, é essencial que o cabo não toque em nenhuma superfície não esterilizada e seja examinado externamente com 70% de etanol antes da coleta em tubos contendo PBS complementados com antibióticos. É importante limitar o tempo entre a coleta do cabo e o processamento …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos ao Sr. Ojas Tikoo pela ajuda nas filmagens e produção de vídeo. Também reconhecemos a ajuda recebida da equipe do GARBH-Ini (Grupo Interdisciplinar de Pesquisa Avançada e Resultado de Nascimento-DBT-Índia), enfermeiros e altos oficiais de pesquisa do Gurugram Civil Hospital e do Dr. Pallavi Kshetrapal para ajudar na logística. Este trabalho foi apoiado por subvenções concedidas a Suchitra Gopinath do Departamento de Biotecnologia da Índia (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).

Materials

4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific D1306
Amphotericin B Sigma Aldrich A2411
Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) HiMedia A001A-50mL
Anti-GAPDH antibody Sigma Aldrich G8795
Anti-MyHC antibody (My32) Novus Biologicals NBP2-50401AF647
Anti-MyoD antibody (5.8A) Novus Biologicals NB100-56511
Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) Novus Biologicals NBP2-34616AF594
Anti-Pax7 antibody DSHB DSHB-C1-576
APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 BD Biosciences 559869
Collagen Type 1 Merck C8919
D (+) Glucose Sigma Aldrich G7021
Dexamethasone SIGMA D4902
FACSCanto II or FACSAria III BD Biosciences
Fetal Bovine Serum, qualified Brazil GIBCO 10270106 not to be heat-inactivated
FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 BD Biosciences 551146
FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 BD Biosciences 557153
FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 BD Biosciences 557508
FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 BD Biosciences 555821
FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 BD Biosciences 555482
FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 BD Biosciences 560840
FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 BD Biosciences 555595
FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 BD Biosciences 557348
FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 BD Biosciences 555786
FlowJo software BD Biosciences
Gentamicin Sigma Aldrich G1264
Horse serum HiMedia RM1239
Hydrocortisone Merck H4001
Laminin Merck L2020
MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides Hyclone SH30568.FS Basal medium for uMSCs
PE Mouse anti-human CD105 clone 266 BD Biosciences 560839
PE Mouse anti-human CD44 clone 515 BD Biosciences 550989
PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 BD Biosciences 555617
PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 BD Biosciences 555787
PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 BD Biosciences 561258
Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 HiMedia M1866
Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) HiMedia TCL049-100mL

Referencias

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  2. Troyer, D. L., Weiss, M. L. Wharton’s jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
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  5. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
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Sevak, J. K., Gopinath, S. D. Generation of Mesenchymal Stem Cells from Human Umbilical Cord Tissue and their Differentiation into the Skeletal Muscle Lineage. J. Vis. Exp. (186), e63725, doi:10.3791/63725 (2022).

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