El protocolo presenta un método para aislar lisados de proteínas de células enteras de procesos faciales de embriones de ratón disecados o células mesenquimas palatales embrionarias de ratón cultivadas y realizar posterior western blotting para evaluar los niveles de proteína fosforilada.
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Artículo de método
Aislamiento de lisados de proteínas de células enteras de procesos faciales de ratón y células mesenquimas palatinas cultivadas para el análisis de fosfoproteínas
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Resumen
Resumen
El desarrollo craneofacial de mamíferos es un proceso morfológico complejo durante el cual múltiples poblaciones celulares se coordinan para generar el esqueleto frontonasal. Estos cambios morfológicos se inician y mantienen a través de diversas interacciones de señalización, que a menudo incluyen la fosforilación de proteínas por quinasas. Aquí, se proporcionan dos ejemplos de contextos fisiológicamente relevantes en los que estudiar la fosforilación de proteínas durante el desarrollo craneofacial de mamíferos: procesos faciales de ratón, en particular procesos maxilares E11.5, y células mesenquimas palatinas embrionarias de ratón cultivadas derivadas de estantes palatinos secundarios E13.5. Para superar la barrera común de la desfosforilación durante el aislamiento de proteínas, se discuten las adaptaciones y modificaciones a los métodos de laboratorio estándar que permiten el aislamiento de fosfoproteínas. Además, se proporcionan las mejores prácticas para el análisis y la cuantificación adecuados de las fosfoproteínas después de la eliminación occidental de lisados de proteínas de células enteras. Estas técnicas, particularmente en combinación con inhibidores farmacológicos y / o modelos genéticos murinos, se pueden utilizar para obtener una mayor comprensión de la dinámica y el papel de varias fosfoproteínas activas durante el desarrollo craneofacial.
Introducción
El desarrollo craneofacial de mamíferos es un proceso morfológico complejo durante el cual múltiples poblaciones celulares se coordinan para generar el esqueleto frontonasal. En el ratón, este proceso comienza en el día embrionario (E) 9.5 con la formación de la prominencia frontonasal y pares de procesos maxilares y mandibulares, cada uno de los cuales contiene células de la cresta neural craneal post-migratorias. Los procesos nasales laterales y mediales surgen de la prominencia frontonasal con la aparición de las fosas nasales y eventualmente se fusionan para formar las fosas nasales. Además, los procesos nasales mediales y los procesos maxilares se fusionan para g....
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Protocolo
Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Campus Médico Anschutz de la Universidad de Colorado y se realizaron de conformidad con las pautas y regulaciones institucionales. Se utilizaron ratones hembra 129S4 a los 1,5-6 meses de edad y alojados a una temperatura subteronetral de 21-23 °C para la recolección de embriones. Un flujo de trabajo esquemático del protocolo se representa en la Figura 1. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, equipos, software, reactivos y animales utilizados en e....
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Resultados
Al intentar caracterizar la fosforilación de proteínas aisladas de procesos faciales de ratón y/o células mesenquimas palatales cultivadas, los resultados representativos idealmente revelarán una banda distinta y reproducible después de Western Blotting con un anticuerpo antifosfoproteína que corre a la altura o cerca de la altura de la banda de proteína total correspondiente (Figura 3 ). Sin embargo, si se produce una fosforilación extensa de la proteína, puede haber un ligero desplazamient.......
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Discusión
El protocolo descrito aquí permite a los investigadores sondear eventos críticos de señalización dependientes de la fosforilación durante el desarrollo craneofacial de una manera robusta y reproducible. Hay varios pasos críticos en este protocolo que aseguran la recopilación adecuada de datos y el análisis de los resultados. Ya sea aislando fosfoproteínas de procesos faciales de ratón y / o células mesenquimas palatales cultivadas, es imperativo moverse de manera rápida y eficiente mientras se mantienen todos los reactiv.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los ratones 129S4 fueron un regalo del Dr. Philippe Soriano, de la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai. Este trabajo fue apoyado con fondos de los Institutos Nacionales de Salud (NIH)/Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial (NIDCR) R01 DE027689 y K02 DE028572 a K.A.F., F31 DE029976 a M.A.R. y F31 DE029364 a B.J.C.D.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| imágenes de quimioluminiscencia | |||
| CO2 incubadora, camisa de aire | VWR | 10810-902 | |
| tablero, 11 x 13 pulgadas | Fisher Scientific | 09 002 12 | |
| Célula de electroforesis, 4 geles, para mini geles prefabricados con módulo mini trans-blot | Bio-Rad | 1658030 | |
| Horno de hibridación | Microcentrífuga Fisher Scientific | UVP95003001 | |
| 5415 D con rotor F45-24-11 (Eppendorf) | Sigma Aldrich | Z604062 | |
| Mini baño seco | Productos de investigación International Corp | 400780 | |
| Agitador orbital | VWR | 89032-092 | |
| Medidor de pH | VWR | 89231-662 | |
| Fuente de alimentación para SDS-PAGE | Bio-Rad | 1645050 | |
| Bandeja de hielo rectangular, maxi 9 L | Fisher Scientific | 07-210-093 | |
| Microscopio estereoscópico Stemi 508 con soporte K Lab, anillo de luz LED | Zeiss | 4350649020000000 | microscopio de disección |
| Temporizador | VWR | 62344-641 | |
| Revólver de tubo | Fisher Scientific | 11 676 341 | |
| Mezclador de vórtice | Fisher Scientific | 02 215 414 | |
| Baño de agua | VWR | 89501-472 | |
| blot box | Fisher Scientific | NC9358182 | |
| Materiales | |||
| Placas de cultivo celular, 6 cm | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| Placas de cultivo celular, 12 pocillos | Fisher Scientific | 07-200-82 | |
| Elevadores de células | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| CO2 | Airgas | CD USP50 | |
| Tubos cónicos, polipropileno, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dumont #5 pinzas finas | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Cuchara para embriones | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Tubos de microcentrífuga, 0,5 mL | VWR | 89000-010 | |
| Tubos de microcentrífuga, 1,5 mL VWR | 20170-038 | ||
| Pipeta Pasteur, 5,75" | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Pipeta Pasteur, 9" | VWR | 14672-380 | |
| Placas de Petri, 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Placas de Petri, 35 mm | Fisher Scientific | ||
| Bolsas, transparente, revestimiento de polietileno | Fisher Scientific | 01-812-25B | |
| Membrana de PVDF | Fisher Pinza Scientific | IPVH00010 | |
| Semken Fine | Science Tools | 11008-13 | |
| Bombilla de látex pequeña, 2 mL | VWR | 82024-554 | |
| Tijeras quirúrgicas | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Filtro de jeringa, 25 mm, 0,2 μ m tamaño de poro | Fisher Scientific | 09-740-108 | |
| Jeringa con punta Luer, 10 mL | VWR | BD309604 | |
| pipeta de transferencia | Fisher Scientific | 13-711-22 | |
| Palanca de apertura de casete Western blot | Bio-Rad | 4560000 | |
| Whatmann 3MM chr papel de cromatografía | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Reactivos | |||
| 4-15% Geles de proteínas prefabricadas, 10 pocillos, 30 y micro; L | Bio-Rad | 4561083 | |
| β-glicerofosfato sódico sal hidrato | Sigma Aldrich | G5422-25G concentración de | existencias 1 M |
| β-mercaptoetanol | Sigma Aldrich | M3148-100ML | |
| Albúmina sérica bovina, fracción V, prueba de choque térmico | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Azul de bromofenol | Fisher Scientific | ||
| Cóctel completo de mini inhibidores de la proteasa | Sigma Aldrich | de | stock de 11836153001 25x |
| Kit de ensayo de proteínas DC II | Bio-Rad | 500-0112 | |
| DMEM, alta glucosa | Gibco | 11965092 | |
| E7, anticuerpo primario de beta tubulina monoclonal de ratón, concentrado 0,1 mL | Estudios del desarrollo Banco de hibridomas | E7 | 1:1.000 |
| Sustrato de Western Blot ECL | Fisher Scientific | PI32106 | rango de picogramos |
| bajo ECL sustrato de Western blot | Genesee Scientific | 20-302B | rango de femtogramo bajo |
| Tampón de electroforesis, 5 L | Bio-Rad | 1610772 | concentración de stock 10x |
| Etanol, 200 pruebas, 1 galón | Decon Laboratories, Inc. | 2705HC | EtOH |
| Ácido etilendiaminotetraacético, dihidra de sal de Di Na. (Poder cristalino/Electróforo.) | Fisher Scientific | BP120-500 | EDTA |
| Suero fetal bovino, caracterizado, origen estadounidense, 500 mL | HyClone | SH30071.03 | |
| Glicerol (certificado ACS) | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Anticuerpo secundario conjugado con HRP, cabra anti-ratón IgG | ImmunoResearch Laboratories | 115-035-146 | :20.000 |
| Anticuerpo secundario conjugado con HRP, cabra IgG anti-conejo Jackson | ImmunoResearch Laboratories | 111-035-003 | 1:20.000 |
| Solución de ácido clorhídrico, 6N (certificado) | Fisher Scientific | SA56-500 | HCl |
| Igepal Ca - 630 detergente no iónico | Fisher Scientific | ICN19859650 | Nonidet P-40 |
| Isopropanol (HPLC) | Fisher Scientific | A451-1 | |
| L-glutamina | Gibco | 25030081 | concentración de existencias 200 mM |
| Metanol | Fisher Scientific | A454-4 | |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) anticuerpo primario | Tecnología de señalización celular | 9102S | 1:1.000; anti-Erk1/2 |
| PDGF-BB ligando recombinante, rata | Fisher Scientific | 520BB050 | |
| PDGF Receptor y beta; anticuerpo primario | Tecnología de señalización celular | 3169S | 1:1.000 |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco 15140122 | concentración de stock 100 U/mL, 100 y micro; g/mL | |
| Fluoruro de fenilmetanosulfonilo, 99% | Fisher Scientific | AC215740100 | PMSF; concentración de existencias 100 mM |
| Anticuerpo primario Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Tecnología de señalización celular | 9101S | 1:1.000, anti-fosfo-Erk1/2 |
| Receptor de fosfo-PDGF y alfa; /Receptor de PDGF y beta; anticuerpo primario | Tecnología de señalización celular | 3170S | 1:1.000 |
| Cloruro de potasio (cristales blancos) | Fisher Scientific | BP366-500 | KCl |
| Fosfato de potasio monobásico (cristales blancos) | Fisher Scientific | BP362-500 | KH2PO4 |
| SDS, 10% | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Cloruro de sodio (cristalino/biológico, certificado) | Fisher Scientific | S671-3 | NaCl |
| Fluoruro de sodio (polvo/ACS certificado) | Fisher Scientific | S299-100 | NaF; alícuota para un solo uso; concentración de existencias 1 |
| M Ortovanadato de sodio, 99% | Fisher Scientific | AC205330500 | Na3VO4; concentración de existencias 100 mM |
| Fosfato de sodio dibásico anhidro (granular o en polvo/ACS certificado) | Fisher Scientific | S374-500 | Na2HPO4 |
| Cultivo de tejidos PBS | Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Tampón de transferencia, 5 L | Bio-Rad | 1610771 | concentración de stock 10x |
| Tris base (cristales blancos o polvo cristalino/biología molecular) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tripsina | BioWorld | 21560033 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| blot marcador de peso molecular | Bio-Rad | 1610374 | |
| Software | |||
| ImageJ software | Institutos Nacionales de Salud | ||
| Animals | |||
| Hembra ratones 129S4 | regalo del Dr. Philippe Soriano, Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai |
Referencias
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
- Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling a....
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Reimpresiones y permisos
