Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

מינון בולוס תוך ורידי מרובים והערכה המודינמית פולשנית במודל יתר לחץ דם של עורק ריאתי בעכבר הנגרם על ידי היפוקסיה

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/63839
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4,5, 4
1Department of Surgery, Yale University School of Medicine, 2Department of Vascular Surgery, The First Hospital of China Medical University, Key Laboratory of Pathogenesis, Prevention, and Therapeutics of Aortic Aneurysm, 3VasoRx Inc., 4Yale Cardiovascular Research Center, Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine, 5Department of Cell Biology, Yale University School of Medicine

Summary

פרוטוקול זה מספק הליך שלב אחר שלב לביצוע מתן מינון בולוס תוך ורידי מרובים וניטור המודינמי פולשני בעכברים. חוקרים יכולים להשתמש בפרוטוקול זה לבדיקת תרכובת טיפולית עתידית ליתר לחץ דם בעורק הריאה.

Abstract

יתר לחץ דם עורקי ריאתי (PAH) היא מחלה מתקדמת ומסכנת חיים, הפוגעת בעיקר בעורקי הריאה הקטנים של הריאה. נכון לעכשיו, אין תרופה עבור PAH. חשוב לגלות תרכובות חדשות שניתן להשתמש בהן לטיפול ב- PAH. מודל PAH הנגרם על ידי היפוקסיה בעכבר הוא מודל בשימוש נרחב למחקר PAH. מודל זה משחזר ביטויים קליניים אנושיים של מחלת PAH Group 3 והוא כלי מחקרי חשוב להערכת יעילותם של טיפולים ניסיוניים חדשים עבור PAH. מחקר באמצעות מודל זה דורש לעתים קרובות מתן של תרכובות בעכברים. עבור תרכובת שצריכה להינתן ישירות לזרם הדם, אופטימיזציה של מתן תוך ורידי (IV) היא חלק מרכזי בהליכי הניסוי. באופן אידיאלי, מערכת הזרקת העירוי צריכה לאפשר זריקות מרובות על פני מסלול זמן מוגדר. למרות שמודל PAH המושרה על ידי היפוקסיה בעכבר פופולרי מאוד במעבדות רבות, זה מאתגר מבחינה טכנית לבצע מינון בולוס IV מרובים והערכה המודינמית פולשנית במודל זה. בפרוטוקול זה, אנו מציגים הוראות שלב אחר שלב כיצד לבצע מינון בולוס IV מרובה דרך וריד הצוואר של העכבר ולבצע צנתור עורקי וחדר ימין להערכה המודינמית במודל PAH הנגרם על ידי היפוקסיה בעכבר.

Introduction

יתר לחץ דם בעורק הריאה (PAH) מוגדר על ידי לחץ סיסטולי ממוצע של עורק הריאה הגדול מ -20 מ"מ כספית במנוחה 1,2. זוהי מחלה פרוגרסיבית וקטלנית המאופיינת בעלייה מתמשכת בלחץ עורקי הריאה, המובילה לעומס יתר בחדר ימין ובסופו של דבר למוות עקב אי ספיקת חדר ימין1. נכון לעכשיו, אין תרופה עבור PAH.

השימוש במודלים של יתר לחץ דם ריאתי בבעלי חיים חשוב לבדיקת יעילותם של טיפולי PAH ניסיוניים. בין מודלים אלה, מודל PAH הנגרם על ידי היפוקסיה בעכבר סיפק תובנות מפתח לגבי התפתחות מחלת PAH 3 בבני אדם 3,4. מחקר המשתמש במודל זה דורש לעתים קרובות מתן של תרכובות בעכברים כדי להעריך את יעילותה ובטיחותה של התרכובת החדשה. לכן, החוקרים זקוקים להליך ניסיוני מפורט עבור מינון מורכב ומדידות המודינמיות כדי להבטיח עקביות הזרקה ושחזור מדידת לחץ דם מההתחלה ועד הסוף.

שיטות להזרקה תוך ורידית (IV) ומדידת לחץ דם דווחו בספרות 5,6. עם זאת, המתודולוגיה חסרה המחשה חזותית ותיאור מפורט. כאן אנו ממחישים את השלבים העיקריים להזרקה מוצלחת של בולוס IV ומדידה ורישום מדויקים של לחץ דם מערכתי וחדר ימין. ההליכים המוצגים כאן הם משאב חשוב לחוקרים המעוניינים בתוואי העירוי של פלטפורמת מתן התרכובת לפיתוח טיפול ב- PAH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדות מוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת ייל.

1. הכנת בעלי חיים, כלים, ציוד למדידת לחץ דם ותא היפוקסיה

  1. התאקלמות בעלי חיים.
    הערה: חיות ניסוי ששימשו למחקר זה היו זכרים, עכברי C57BL/6 בני 8 שבועות במשקל 25-27 גרם. יש לקחת בחשבון מספר גורמים בעת הערכת מספר בעלי החיים הדרושים לניסוי, כולל תמותה הקשורה לניתוח, סיבוכים כירורגיים בלתי צפויים ומוות פתאומי בלתי צפוי. השתמשו בלפחות 10 עכברים בכל קבוצה כדי להגיע לכוח סטטיסטי ולהימנע ממחקרים חלשים.
    1. עם קבלת הפנים, אכסנו את בעלי החיים בכלובי מכרסמים מאווררים (קבוצות של חמישה בעלי חיים בכל כלוב) המסופקים עם מצעים מתאימים, צ'או מכרסמים ומים. תנו לבעלי החיים להתאקלם לסביבה החדשה (מחזור אור-חושך של 12 שעות ב 18-20 מעלות צלזיוס) למשך 3 ימים לפחות.
    2. הקצה אותם באופן אקראי לקבוצות הבאות: נורמוקסיה (קבוצה 1), היפוקסיה (קבוצה 2), והיפוקסיה + 7C1/let-7 miRNA (קבוצה 3).
  2. כלי ניתוח והכנת ציוד למדידת לחץ דם.
    1. עיקרו את כל כלי הניתוח על-ידי אוטוקלאבינג (איור 1A).
    2. הכינו משטח הזרקה מאולתר עם חרוט אף בהרדמה ביתית (איור 1B), חבילות תפרים (איור 1C) וציוד להליך PAH (איור 1D-F).
  3. הגדרה ניסיונית להשראת יתר לחץ דם בעורק הריאה (PAH).
    1. הגדירו את מכל N2 , את חיישן החמצן ואת תא ההיפוקסיה הניתן לאיטום למחצה (איור 2A).
    2. קבעו נקודה קבועה של 10% O2 בחיישן החמצן ותנו למערכת להגיע למצב יציב (איור 2B, C).
    3. שמור היפוקסיה (קבוצה 2) ו hypoxia + 7C1 / let-7 miRNA (קבוצה 3) בעלי חיים היפוקסיה (10% O2) במשך 3 שבועות. לאחר 3 שבועות של היפוקסיה, הניחו את החיות בתנאים נורמוקסיים למשך שבוע אחד (איור 2D). הקבוצה הנומוקסית (קבוצה 1) נשארת בנורמוקסיה במשך 4 שבועות.
      הערה: (1) 3 שבועות של היפוקסיה ואחריה שבוע אחד של נורמוקסיה היא שיטה מבוססת היטב לפיתוח PAH ואי ספיקת לב בחדר ימין7. חיישן החמצן מזהה ריכוז O2 בתוך תא ההיפוקסיה הניתן לאטימה למחצה ומתקן אותו על ידי החדרת גז N2 דרך צינור עירוי הגז.
    4. בדוק את בעלי החיים מדי יום במשך כל תקופת הניסוי (3 שבועות). התייעצו עם וטרינר אם בעלי החיים מראים סימני מצוקה כגון ירידה דרמטית במשקל וקשיי נשימה. אם המתת חסד נחוצה לבעלי חיים במצוקה חמורה, להוציא את החיה מהמחקר.
      הערה: חשיפה להיפוקסיה גורמת לירידה במשקל גוף העכבר. ירידה של 10% ממשקל הגוף משמשת בדרך כלל כאינדיקציה אמינה להתפתחות PAH.
    5. הימנע פתיחה נרחבת של תא היפוקסיה. לניקוי כלובים, חידוש מזון, החלפת בקבוקי מים וניהול מתחם, פתחו את התאים לא יותר משעה בשבוע.

2. הזרקת בולוס תוך ורידית דרך הווריד הצווארי

  1. הכנת עכבר והרדמה.
    1. הוציאו את כלובי העכבר היפוקסיה (קבוצה 2) והיפוקסיה + 7C1/let-7 miRNA (קבוצה 3) מתא ההיפוקסיה והוציאו בעדינות את בעל החיים מהכלוב.
      הערה: משטר המינון של 7C1/let-7 miRNA (1.5 מ"ג/ק"ג IV/מנה) הוא פעמיים בשבוע למשך 4 שבועות של טיפול. מומלץ לחוקרים להוציא הן את כלובי הטיפול בהיפוקסיה והן בהיפוקסיה + מורכבים מתא ההיפוקסיה במהלך הזרקת העירוי כדי לוודא שכל בעלי החיים מקבלים את אותו סדר גודל של חשיפה להיפוקסיה בכל מרווח זמן.
    2. שקלו את העכבר באמצעות סולם מדויק ורשמו את משקלו (איור 3A).
    3. הכניסו את העכבר לתא השראת הרדמה המחובר לוופוריזר ההרדמה וסגרו אותו (איור 3B). לספק תמיכה תרמית ולמרוח חומר סיכה לעיניים על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות בזמן ההרדמה. חשוף את העכבר לאיזופלורן 3% עד שהוא מאבד את הכרתו (איור 3C-D).
    4. מוציאים את העכבר מהחדר ומגלחים את הפרווה מהלסת בצורה גולגולתית לאמצע עצם החזה. לרוחב, גלחו את הפרווה מזוויות הלסת, דרך צידי הצוואר ולכיוון הכתפיים (איור 3E).
    5. הניחו את העכבר המורדם באיזופלורן במצב שכיבה (צד הבטן עם הפנים כלפי מעלה) על משטח הזרקה מתחת למיקרוסקופ דיסקציה. שמרו על ההרדמה באמצעות חרוט אף עם 1.5% איזופלורן וריסנו בעדינות את ארבע הרגליים באמצעות סרט הדבקה כדי לשתק את הגוף (איור 3F).
    6. החל גירוי מזיק (כלומר, צביטת בוהן) עם מלקחיים ישרים כדי להבטיח רמה נאותה של הרדמה. העכבר המרדים לא אמור להגיב לגירוי לפני ובמהלך ההליך הכירורגי.
  2. הכנת חומר הזרקה.
    1. הכינו תרכובת הזרקה במינון של 1.5 מ"ג/ק"ג בתנאים סטריליים.
      הערה: יש לחמם את תרכובת ההזרקה לטמפרטורת החדר (RT) מכיוון שהזרקת חומרים קרים עלולה לגרום לאי נוחות ולירידה בטמפרטורת גוף העכבר (אם הדבר אינו פוגע בתרכובת). המינון ומשך הזמן האופטימליים של תרכובת 7C1/let-7 miRNA המשמשים במחקר זה מבוססים על פרסומים קודמים 8,9.
    2. טען את המזרק הסטרילי לשימוש חד פעמי בנפח שיש להזריק. החזיקו את המזרק זקוף וקדמו את הבוכנה כדי להוציא את האוויר מהמזרק. אין לעשות שימוש חוזר במזרק.
    3. הגבל את נפח ההזרקה ל -200 μL בעכבר של 25 גרם כדי להפחית את שכיחות ההמודילוציה והשפעות לבביות חריגות על בעלי החיים. אם נדרש נפח גדול יותר, חלקו את תרכובת ההזרקה לשתי זריקות במרווח של 10 דקות.
  3. הכן את העכבר להזרקת IV.
    1. קרצוף בעדינות את אזור הניתוח שלוש פעמים עם שלושה סבבים לסירוגין של תמיסת פובידון-יוד ואתנול 70%. מתן buprenorphine (0.05 מ"ג / ק"ג, SQ) 30 דקות לפני ההליך הכירורגי.
    2. בצעו חתך אורכי של 0.5 ס"מ מעט מימין לקו האמצע של הצוואר באמצעות להב אזמל (איור 3G).
    3. השתמשו במלקחיים כדי להפריד בין השריר לרקמות השומן כדי לאתר את וריד הצוואר החיצוני הימני (איור 3H).
      הערה: סובב את אתרי ההזרקה בכל פעם כדי למנוע היווצרות צלקת.
    4. השתמשו בעדשה אובייקטיבית בעלת עוצמה גבוהה כדי לאפשר הדמיה קלה של אזור ההזרקה (איור 3I).
  4. הזרקת IV
    1. הכניסו מחט סטרילית במשקל 28 G לווריד הצוואר כשהמחט משופעת כלפי מעלה (איור 3J, K).
      הערה: הזרקת וריד זנב היא חלופה להזרקת ורידים ג'וגולריים. עם זאת, טכניקה זו קשה לביצוע מינון חוזר בשל השונות בעומק הוורידים, צבע עור זנב עכברים וקשיות העור.
    2. לחץ באיטיות על בוכנה מזרק כדי להזריק את התרכובת לתוך הווריד. אפשרו למחט להישאר בתוך הווריד במשך 10 שניות נוספות כדי למנוע זרימה חוזרת של המזרק (איור 3L).
      הערה: הצבע הכחלחל מאפשר הדמיה קלה של ההזרקה. אין לכלול את הצבע בעת הזרקת חומרי הבדיקה. הזרקה לא מדויקת תגרום להצטברות צבע כחלחל סביב אתר ההזרקה בעירוי.
    3. הסירו את המחט והשתמשו בצמר גפן כדי להפעיל לחץ על אתר ההזרקה כדי למנוע דימום (איור 3M).
    4. תפרו את העור בתפר 5-0 (איור 3N). לאחר הניתוח, העבירו את בעל החיים לאזור חם, נקי ויבש וספקו Meloxicam (1 מ"ג/ק"ג, SQ, q24h). הניחו את בעל החיים בכלוב התאוששות נקי ללא מצעים אך התחתית מכוסה במגבת נייר.
      הערה: העכבר צריך להיות ער מהרדמה ולחזור להכרה תוך 5 דקות ברגע שהוא חוזר לכלוב ההתאוששות. עקוב אחר העכבר לאיתור סימני מצוקה.
    5. החזירו את החיות לכלוב הביתי שלהן והחזירו את כלוב העכבר לתא ההיפוקסיה.
      הערה: ההליך כולו, החל מהרדמת עכבר ועד סיום הזרקת ורידים ג'וגולריים, אורך כ-10-15 דקות על ידי נסיין יחיד. כדי לקצר את החשיפה לנורמוקסיה בעכברים, מומלץ שלפחות שני חוקרים ישתפו פעולה כדי לבצע הליך הזרקת ורידים ג'וגולריים.

3. מדידת לחץ דם

  1. הכינו מכשירים למדידת לחץ דם.
    1. השרו את קצה הצנתר בטמפרטורה של 1.0 F ב-PBS שחומם מראש בטמפרטורה של 37°C לפחות 30 דקות לפני מדידה המודינמית (איור 4A).
    2. יש למדוד את המרחק מאתר החדרת הצנתר למיקום קצה הצנתר הרצוי. לדוגמה, המרחק בין אבי העורקים העולה של העכבר לאמצע הצוואר הוא כ 1-1.2 ס"מ. המרחק בין החדר הימני של הלב לאמצע הצוואר הוא כ 2.3-2.8 ס"מ.
    3. סמן שני סימוני מרחק צנתר כדי לספק אינדיקציה חזותית לעומק החדרה (איור 4B).
    4. חבר את הצנתר למתמר הלחץ, חבר את מתמר הלחץ לערוץ הקלט 1 במכשיר איסוף הנתונים, הפעל את יחידת בקרת עוצמת הלחץ והפעל תוכנה לניתוח לחץ דם לרכישת נתונים. צור מסמך ניתוח לחץ דם חדש והגדר ערוץ 1 ללחץ.
    5. בצע כיול לחץ בהתאם לפרוטוקול היצרן. אפשרו למערך כולו להתייצב למשך 5 דקות לפחות (איור 4C).
    6. בתוכנה לניתוח לחץ דם, בחר המרת יחידות מהתפריט הנפתח של ערוץ 1 (איור 4D, חץ אדום).
    7. הגדר את ערכי ברירת המחדל של המרת יחידות (איור 4E).
      הערה: לחץ הדם מיוצג כמילימטרים של כספית (mmHg). תפוקת הלחץ המתוקננת מיחידת בקרת הלחץ היא V אחד לכל 100 מ"מ כספית. 25 מ"מ כספית מתאים לפלט של 0.25 וולט, ו -100 מ"מ כספית מתאים לפלט של 1 וולט.
  2. הכן את העכבר להליך מדידת לחץ הדם.
    1. מרדימים את העכבר עם שאיפת איזופלורן 3% דרך חרוט האף.
    2. יש למרוח את המשחה הווטרינרית ישירות על משטח העין של עיני העכבר כדי למנוע יובש, מכיוון שהעכבר אינו יכול לעצום את עיניו תחת הרדמה. יש לגלח את הפרווה מצווארו של העכבר בזמן הרדמה.
    3. קרצוף את האזור המגולח עם שלושה סבבים לסירוגין של תמיסת פובידון-יוד וספוגית אתנול 70%. הניחו את העכבר המרדים במצב שכיבה על משטח הזרקה מתחת למיקרוסקופ דיסקציה. הכניסו את אפו של העכבר לקונוס האף כדי לשמור על הרדמה (1.5% איזופלורן) לאורך כל ההליך הכירורגי.
    4. בדוק את התגובה המוטורית של העכבר המרדים לגירוי המזיק. העכבר המרדים לא אמור להגיב לגירוי מזיק לפני הניתוח ובמהלכו.
      הערה: חומרי הרדמה הניתנים לשאיפה (איזופלורן) והזרקה (קטמין/קסילזין) יכולים להפחית את לחץ הדם. באופן כללי, להרדמה באינהלציה איזופלורנית יש השפעה קלה על הורדת לחץ הדם מאשר קטמין/קסילזין. לכן, איזופלורן הוא חומר ההרדמה הממסים המועדף על פני קטמין/קסילזין. השגת עומק ההרדמה המתאים היא קריטית למדידות המודינמיות מדויקות וניתנות לשחזור. החוקר צריך לשמור על עומק הרדמה קבוע עבור כל עכבר.
  3. צנתור אבי העורקים עולה
    1. החל גירוי מזיק (כלומר, צביטת בוהן) עם מלקחיים ישרים כדי להבטיח רמה נאותה של הרדמה. בצעו חתך בקו האמצע של העור מהלסת התחתונה ועד עצם החזה (איור 5A).
    2. הפרידו את בלוטות הרוק וחשפו את קנה הנשימה (איור 5B).
    3. השתמשו במלקחיים כדי לנקות את הרקמה הרכה לאורך כלי הדם כדי לחשוף את עורק התרדמה הימני ואת וריד הצוואר החיצוני הימני (איור 5C).
    4. שים 0.5 מ"ל של PBS בחלל כדי להאט את התפתחות vasospasm תוך מניפולציה של עורק התרדמה.
    5. בודד בזהירות קטע של 5 מ"מ מעורק התרדמה הימני. הניחו פיסת נייר לבן סטרילי מתחת לכלי הדם כרקע כדי להפוך את העורק לגלוי יותר (איור 5D).
      הערה: יש להפריד בזהירות את העצב התועה (לבן) מהעורק ולהקפיד לא לחתוך או לפגוע בעצב או בעורק.
    6. שימוש ב-8-0 תפר לקשור קשר קבוע # 1 כדי לסגור את קצה הגולגולת של כלי הדם (איור 5E).
    7. קשר רופף ראשון כדי לחסום זמנית את זרימת הדם מאבי העורקים. לאחר מכן, קשרו קשר רופף שני בין שני התפרים הראשונים (איור 5F). הקשר הרופף השני ישמש כדי לאבטח במהירות את הצנתר לאחר המיקום.
    8. באמצעות מחט של 25 גרם, צרו חור קטן, גדול מספיק כדי להעביר את הצנתר, בקו אחד עם כלי הדם בין ליגטורות #3 ו-#1 (איור 5G).
      הערה: עורקי התרדמה נושאים דם מחומצן מהלב ויש להם לחץ גבוה מאוד. אם עורק התרדמה נחתך, הלחץ הזה יגרום לדם לזלוג החוצה (איור 5H).
    9. החזיקו את הצנתר במרחק של 1.5 אינץ' מהקצה והכניסו בעדינות את קצה הצנתר דרך חור העורק (סימן X). הדקו את צומת התפר האמצעית (# 3) סביב הצנתר וכלי הדם שעדיין מאפשרים מעבר של הצנתר (איור 5I-J).
      הערה: שלב זה דורש תרגול. הסיבוכים האפשריים בשלב זה כוללים דימום באתר החדרת הצנתר ווזוספאזם. כאשר מתרחש דימום, איבוד דם מהעורק המדמם מפחית את נפח הדם, מה שמוביל לירידה חמורה בלחץ הדם המערכתי. בשל חומרת החומרה, בעל החיים הגיע לנקודת קצה הומנית ויש להרדים אותו. עבור vasospasm המושרה מכנית, זה קורה בדרך כלל במהלך החדרת קטטר הנגרמת על ידי התכווצות מתמשכת של כלי הדם. זה הופך את פתיחת כלי הדם לקטנה יותר ומונע התקדמות קטטר לעורק התרדמה. אין להשתמש בכוח מופרז כנגד התנגדות כדי לקדם את הצנתר. כאשר נתקלים בהתנגדות מתונה או חמורה של כלי הדם, נסו שוב לאחר זמן מה או השתמשו בצנתר קטן יותר (למשל, 1.0 F). מיקרוכירורגים מנוסים יכולים להשיג 100% אחוזי הצלחה לצנתור אבי העורקים העולה.
    10. לאחר שהקטטר עובר את הקשר הרופף הראשון עם קצה החיישן, הדקו את הקשר הרופף השני חזק יותר כדי לאבטח את הצנתר ושחררו בעדינות את הקשר הרופף הראשון (איור 5K, L).
    11. המשיכו להחדיר את הצנתר לכיוון אבי העורקים העולה בהתאם לסימן שעל הצנתר (איור 4B) עד שבדיקת הלחץ תראה פרופיל לחץ דם עורקי (איור 5M). רשום נתוני לחץ דם מערכתי (SBP) באמצעות מערכת רכישת הנתונים והתוכנה.
    12. שחררו את צומת התפר האמצעית כדי לאפשר את הוצאת הצנתר החוצה (איור 5N).
    13. קשרו את צומת התפר האמצעית (# 3) סביב כלי הדם לפני שתוציאו את הצנתר מעורק התרדמה (איור 5O-P).
    14. הכניסו את הצנתר ל-PBS.
  4. צנתור לב ימין.
    1. בודדו בזהירות את וריד הצוואר החיצוני הימני מרקמת החיבור שמסביב וקשרו את כל הענפים הקטנים עם 8-0 תפר (ראשי חץ כחולים) (איור 6A).
      הערה: עבור צנתור לב ימין, הלב נגיש בדרך כלל דרך וריד הצוואר הימני.
    2. שימוש ב-8-0 תפר, לקשור קשר קבוע # 1 כדי לסגור את קצה הגולגולת של כלי הדם (איור 6B). לאחר מכן, קשרו קשר רופף בקצה הקאודלי של הכלי (איור 6C).
    3. השתמשו במחט 25 G כדי ליצור חור קטן קרוב לקשר הקבוע (# 1) (איור 6D).
      הערה: ורידים Jugular לשאת דם לא מחומצן ללב ויש להם לחץ נמוך. אם חותכים את הווריד הצווארי, הדם לא יזלוג החוצה (איור 6D, E).
    4. החזיקו את הצנתר והכניסו את הצנתר לתוך חתך הווריד (סימן X) (איור 6E) והדקו את הקשר הקאודלי סביב הצנתר וכלי הדם (איור 6F).
    5. דוחפים לאט ובעדינות את הצנתר לתוך הלב הימני. עקוב אחר עומק קצה הצנתר בהתבסס על סימן הצנתר (איור 4B).
      הערה: הערכת הלחץ הסיסטולי של החדר הימני (RVSP) בעכברים בעלי חזה סגור היא אתגר בגלל האנטומיה והמבנה המורכבים של RV. שלב זה דורש רמה גבוהה של מומחיות והרבה תרגול. בידיו של מיקרוכירורג מנוסה, שיעור ההצלחה של צנתור חדר ימין יכול להתקרב ל -90%.
    6. הערך את מיקום קצה הצנתר בהתאם למעקב אחר גלי הלחץ בתוכנה. כאשר קצה הצנתר נמצא בחדר הימני, הצג יציג מעקב RVSP טיפוסי (איור 6G, H).
      הערה: כאשר הצורה של עקומות לחץ ריאתי נראית לא טיפוסית (למשל, עקומות קוצניות), זה מרמז על מיקום שגוי של הצנתר. כוונן את מיקום הצנתר על ידי משיכה עדינה של הצנתר מעט לאחור, ולאחר מכן התקדמות איטית של הצנתר למיקום מרכזי יותר בתוך החדר הימני. כדי למנוע יצירת ממצאים בנתוני מחקר, על החוקר להימנע מניסיונות ממושכים (לא יותר מדקה) או חוזרים ונשנים (לא יותר משני ניסיונות) בצנתור חדר ימין.
    7. שמור על הצנתר ללא תנועה ואסוף את הנתונים למשך 5 דקות.
    8. לאחר השלמת ההקלטה, משכו בזהירות את הצנתר החוצה וקשרו את הקשר הקאודלי סביב כלי הדם (איור 6I). החזירו את הצנתר לתמיסת PBS.
      הערה: לאחר סיום הניסוי יש לנקות את הצנתר בתמיסת אנזימי עיכול 1% בהתאם להוראות היצרן. בנוסף להערכת המצב המודינמי, החוקרים עשויים לקצור את הלבבות והריאות לבדיקה היסטופתולוגית של PAH. כדי להבטיח את היעילות של מינון בולוס IV מרובים, החוקרים יכולים לבודד תאי אנדותל ריאות ולמדוד רמות let-7 miRNA.

4. ניתוח נתוני לחץ דם

  1. בדוק את רישום לחץ הדם.
    1. פתח את קובץ הנתונים של תוכנת ניתוח לחץ הדם (PAH JOVE.adicht).
    2. בערוץ 1, בחרו אזור המייצג את אות הלחץ ומקמו את סמן צורת הגל על הפסגה (סימן X) כדי למדוד את משרעת הלחץ (איור 7A).
    3. קבע את המשרעת המקסימלית של גל הלחץ. זה מייצג את הלחץ הסיסטולי (איור 7A, חץ אדום).
    4. חלץ את אזור העניין (איור 7B , אזור אפור) מהתמונה על-ידי הקשה על Shift + Command + 3 (עבור Mac) או Windows + Shift + S (עבור Windows PC) והדבק אותו בקובץ גרפיקה.
  2. ניתוח סטטיסטי של נתוני לחץ דם.
    1. הזן את נתוני לחץ הדם של העכבר הבודד בתוכנת ניתוח סטטיסטי.
    2. בצע מבחן t של סטודנט לא מזווג לניתוח סטטיסטי של שתי קבוצות מחקר (נורמוקסיה לעומת היפוקסיה; היפוקסיה לעומת היפוקסיה + 7C1/let-7 miRNA). שקול את ההבדלים בערכים ממוצעים משמעותיים כמו p < 0.05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הרדמה לעתים קרובות מפחיתה את לחץ הדם. לכן, מינון מינימלי של הרדמה שימש כדי לבטל את התנועות בתגובה לגירוי מזיק. ניתן לדמיין גישה מוצלחת לחדר החדר הימני כאשר צורת הגל ההמודינמית משתנה באזורים שונים של מערכות ורידיות (איור 8).

במחקר זה, עכברים חולקו באופן אקראי לקבוצת נורמוקסי (21% O2) (n = 10), היפוקסיה (10% O2) (n = 10), או היפוקסיה + 7C1 / let-7 קבוצת טיפול (n = 10). כדי לבחון את ההשפעה של let-7 miRNA בדיכוי התפתחות PAH הנגרמת על ידי היפוקסיה, נוסחת miRNA 7C1/let-7 ניתנה לעכברי C57BL/6 תוך ורידי במינון של 1.5 מ"ג/ק"ג פעמיים בשבוע במשך 4 שבועות (איור 2D).

4 שבועות לאחר החשיפה להיפוקסיה או נורמוקסיה, SBP ו- RVSP נמדדו בעכבר בעל חזה סגור. איור 9A מראה את עקומת לחץ הדם המייצגת מקבוצות הטיפול בנורמוקסי, היפוקסיה או היפוקסיה + 7C1/let-7 miRNA. בהשוואה לאלו בקבוצת הביקורת של נורמוקסיה, RVSP גדל באופן משמעותי בקבוצת ההיפוקסיה. נוסף על כך, בהשוואה לקבוצת ההיפוקסיה, טיפול בתרכובת miRNA 7C1/let-7 בעכברים הביא לירידה משמעותית ב-RVSP (איור 9B). SBP לא השתנה באף קבוצה, מה שעולה בקנה אחד עם הדוחות הקודמים7. 7C1/let-7 miRNA מכוון לתאי אנדותל ומקטין את מפל האיתות TGFβ8. הנתונים מראים כי 7C1/let-7 miRNA 1.5 מ"ג/ק"ג יעיל מאוד בהורדת לחץ הדם בחדר הימני, ומדגים את היעילות של מינון בולוס מרובה IV.

Figure 1
איור 1: מכשירים כירורגיים וציוד למדידת לחץ דם הדרושים להליכים של יתר לחץ דם בעורק הריאה. (A) כלים כירורגיים המשמשים להליך PAH. (B) משטח הזרקה מאולתר עשוי מפד סופג הכרוך סביב מתלה קלקר מאריזה חרוטית של 50 מ"ל. חיבור צינור הרדמה באורך 10 ס"מ לפלטפורמת ההזרקה כחרוט אף עם סוג. (C) חבילות תפרים. תפר 5-0 לסגירת חתך ו-8-0 תפר לקשירה. (ד-ו) ציוד למדידת לחץ דם המשמש להליך PAH. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הגדרה ניסיונית להשראת PAH. (A) צילום של הקמת מערכת היפוקסית BioSpherix. חלקים שונים של מערכת האינדוקציה מסומנים. (ב-ג) חיישן חמצן המנטר את תא ההיפוקסיה O2 ריכוז. (D) ציר זמן ניסיוני לטיפול בתרכובת miRNA 7C1/let-7 וחשיפה לרמת חמצן לכל קבוצות בעלי החיים במהלך השראת PAH. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: צילומים של שלבים ניתוחיים מרכזיים להזרקת ורידים ג'וגולריים. (A) עכבר בסולם משקל. (B) התקנת מערכת השראת הרדמה מכרסמים. חלקים שונים של מערכת האינדוקציה מסומנים. (ג-ד) תמונות של עכבר מורדם איזופלורן בתא אינדוקציה. (E) פרווה שהוסרה באזור הניתוח. (F) עכבר שהונח על משטח הזרקה ונשם 1.5% איזופלורן דרך חרוט אף ממכשיר אידוי. (G) חתך בעור לגישת הווריד הצווארי. (H) דיסקציה כירורגית של וריד הצוואר החיצוני הימני. (I) הדמיית הגדלה גבוהה יותר המראה את וריד הצוואר הימני המבודד. שימו לב לנייר לבן מתחת לכלי, מה שהופך את הווריד לגלוי יותר. (י-ק) החדרת מחט וריד ג'וגולרי ימני עם השיפוע כלפי מעלה. (L) הזרקת תרכובת עם צבע כחלחל לווריד הצוואר. (M) הפעלת לחץ על מקום ההזרקה באמצעות צמר גפן לאחר משיכת המחט. (N) תפירת הפצע בתפר 5-0. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: כיול צנתרים. (A) השריית קצה צנתר 1.0 F ב-PBS שחומם מראש ב-37°C. (B) סימוני מרחק על הצנתר כדי לסייע בהערכת עומק החדרת הצנתר לאבי העורקים העולה ולחדר הימני. (C) ציוד למדידת לחץ דם העובר כיול אפס קו בסיס. (כא') צילום מסך של ניתוח לחץ דם מבוסס תוכנה לניתוח צנתר בסיסי. (ד) בתפריט הנפתח של ערוץ 1 , בחר בתיבת הדו-שיח המרת יחידות בתוכנה לניתוח לחץ דם. (E) הגדרת ערכי ברירת המחדל של המרת יחידות להמרת אות מתח הכניסה ליחידת mmHg. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: הליכים כירורגיים למדידות לחץ דם מערכתי (SBP). (A) חתך בקו האמצע מהלסת התחתונה ועד עצם החזה בעור הצוואר. (B) הפרדת בלוטת הרוק לחשיפת קנה הנשימה. (C) עורק התרדמה הימני החשוף ווריד הצוואר הימני החיצוני לאחר דיסקציה של רקמות. (D) קטע מבודד בקוטר 5 מ"מ של עורק התרדמה. (ה,ו) קשר קבוע תפר בגפיים הגולגולתיות ושני קשרים רופפים בגפיים הקאודליות. (ז,ח) ביצוע חור קטן (סימן X) על עורק התרדמה רק caudal לקשר קבוע # 1. (I) החדרת הצנתר לעורק התרדמה. (J) אבטחת הצנתר עם קשר תפר אמצעי . (יא,ל) משחרר בעדינות את הקשר הרופף הראשון . (M) גלי לחץ עורקיים מייצגים. (N) התרופפות צומת התפר האמצעית . (O,P) הידוק צומת התפר האמצעית סביב כלי השיט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: הליכים כירורגיים למדידות לחץ סיסטולי בחדר ימין (RVSP). (A) קשירת הענפים הקטנים של וריד הצוואר הימני (ראשי חץ כחולים). (B) קשר קבוע # 1 בקצה הגולגולת של וריד הצוואר. (C) קשר רופף בקצה הקאודלי של הווריד הצווארי. (D) יצירת חור קטן בווריד הצוואר הימני קאודלי לקשר הקבוע (# 1). (E) החדרת קטטר לווריד הצוואר דרך חור קטן (סימן X). (F) הידוק הקשר הקאודלי סביב הצנתר וכלי השיט. (G) דחיפת הצנתר לחדר הימני של הלב. (ח) נציג RVSP. (I) הידוק הצומת הקאודלי סביב כלי השיט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: ניתוח נתוני תוכנה לניתוח לחץ דם לאחר הקלטה. (A) שימוש בסמן צורת גל למדידת משרעת לחץ מנתוני התוכנה לניתוח לחץ דם גולמי בערוץ 1. (B) חילוץ האזור המעניין מתמונת הנתונים של תוכנת ניתוח לחץ הדם הגולמי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: מעבר צורת גל המודינמית במהלך צנתור חדר ימין. (A-D) עקבות מייצגות של שינויי לחץ במהלך צנתור חדר ימין של עכבר C57BL/6. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9: נתוני ייצוג של ניתוח לחץ דם וניתוח נתונים. (A) עקומות SBP ו-RVSP מייצגות בעכברים שטופלו בנורמוקסיה, היפוקסיה והיפוקסיה + 7C1/let-7 miRNA שטופלו. (B) חלקות סיכום של SBP ו-RVSP בעכברים שטופלו בנורמוקסיה, היפוקסיה והיפוקסיה + 7C1/let-7 miRNA עכברים (NS: לא משמעותי; **p < 0.01; ***p < 0.001; מבחן t של סטודנט דו-זנבי לא מזווג). N = 10 לקבוצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מספר מודלים של יתר לחץ דם ריאתי בבעלי חיים הוקמו כדי לחקות את אירועי התנגדות כלי הדם הריאתיים הגבוהים בנבדקים אנושיים. ביניהם, מודל PAH הנגרם על ידי היפוקסיה בעכבר נמצא בשימוש נרחב להערכת היעילות של טיפולים ניסיוניים חדשים עבור PAH. מחקר באמצעות מודל זה דורש לעתים קרובות מתן של תרכובות לעכברים. בהשוואה לפרוטוקולים אחרים שפורסמו של הזרקה תוך ורידית (IV) והערכה המודינמית פולשנית, שיטה זו מספקת הן המחשה חזותית והן תיאור מפורט.

ישנם שלושה שלבים קריטיים לביצוע מוצלח של ההליך ולהשגת מדידות לחץ דם מדויקות וניתנות לשחזור. ראשית, ודא שמחט המזרק ממוקמת כראוי בווריד הצוואר. הזרקת ורידים ג'וגולרית שגויה עלולה לגרום להזרקה תת עורית. שנית, לוודא עומק מספיק של הרדמה. עומק הרדמה עקבי בכל עכבר חשוב ליצירת נתונים הניתנים להשוואה בין קבוצות. הרדמה עמוקה מדי עלולה לגרום לירידה משמעותית ברמות לחץ הדם. בנוסף להרדמה באינהלציה איזופלורנית, הזרקה תוך צפקית של קטמין/קסילזין היא שיטת הרדמה נפוצה נוספת לניתוחי עכברים. לשתי השיטות יתרונות וחסרונות. להרדמה באינהלציה איזופלורנית מספר יתרונות על פני הזרקת קטמין/קסילזין, כולל התפרצות מהירה, ללא תרופות מבוקרות, התאוששות מהירה, וקל הרבה יותר לשלוט בעומק ההרדמה. החסרונות הם עלות הציוד, ריח לא נעים וחשיפה אנושית לגזי הרדמה פסולת. שלישית, ודא שהקטטר נמצא בתוך החדר הימני של הלב. ניסיונות כושלים ממושכים או מרובים בצנתור חדר ימין עלולים לגרום לקריאות לחץ דם שגויות.

הזרקת IV בעכברים ניתנת בעיקר דרך ורידי הזנב הרוחביים. בעוד מסלול זה קל להגיע עם מחטים, טכניקה זו היא לפעמים קשה לבצע מינון בולוס IV מרובים. שני האתגרים העיקריים בביצוע טכניקה זו הם השונות בעומק הוורידים והקושי בהדמיה של מחט עקב עכברים, זנב, צבע עור וקשיות העור. חשוב מכך, אין דרך לאשר אם כל תוכן הזריקה נכנס בהצלחה לזרם הדם ולא לרקמות הסובבות אותו. הווריד הצווארי הוא אתר גישה מועדף מכיוון ש-(1) הוא רלוונטי מבחינה קלינית, (2) הוא מספק אישור חזותי למסירת ההזרקה לווריד, (3) הוא מאפשר זריקות מרובות של קבוצת בעלי חיים במהלך הניסוי, ו-(4) טכניקת הזרקה זו בטוחה, וההליך אינו גורם לתופעות לוואי כלשהן.

ישנן שלוש דרכים לרשום לחץ דם בעכברים: (1) פלטיסמוגרפיה לא פולשנית של שרוול הזנב10. המערכות מאפשרות מדידות חוזרות ונשנות במהלך מחקר אורך. (2) טלמטריית רדיו11. המערכות מאפשרות ניטור לחץ דם בזמן אמת בחיות מעבדה ערות וחופשיות. (3) צנתרים תוך-עורקיים פולשניים12. המערכות מאפשרות מדידות SBP ו-RVSP אקוטיות. בפרוטוקול זה בחרנו בצנתר לחץ למדידות לחץ סיסטמי ובחדר ימין באיכות גבוהה. עם זאת, שיטה זו יש כמה מגבלות. ראשית, צנתר הלחץ וציוד מדידת לחץ הדם יקרים (איור 1E-F). שנית, זה דורש הרדמה של בעלי החיים, זה גורם לירידה בלחץ הדם. שלישית, צנתור לב ימין הוא הליך סופני שאינו מאפשר מדידות סדרתיות. רביעית, ההליך אינו קל ללמוד אפילו על ידי מיקרוכירורג מאומן היטב.

לאחר רישום לחץ הדם, החוקר יכול לבודד את הלבבות והריאות מבעלי החיים לצורך אפיון PAH היסטולוגי. לדוגמה, מדידות עובי דופן החדר הימני עבור היפרטרופיה של החדר הימני וניתוח כלי דם דיסטלי ריאתי שרירי לעיצוב מחדש של עורק ריאתי שרירי. הנתונים מראים כי 7C1/let-7 miRNA יעיל מאוד בהורדת לחץ דם ריאתי, מה שמדגים את היעילות של מינון בולוס בעירוי מרובה שלנו. בנוסף, חוקרים יכולים לבודד תאי אנדותל של הריאה מהריאה השלמה שזה עתה בודדה כדי להעריך את היעילות של חומרים מוזרקים.

לסיכום, פרוטוקול זה מספק הליך שלב אחר שלב לביצוע מינון בולוס IV מרובים וניטור המודינמי פולשני במודל PAH המושרה על ידי היפוקסיה בעכבר. החוקרים יכולים להשתמש בהזרקת ורידים ג'וגולריים ובטכניקות צנתור עורקי/חדר ימין המתוארות כאן עבור מגוון רחב של דגמי מכרסמים הדורשים הזרקה בעירוי וניטור המודינמי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

K Zsebo, M Simons ו- P-Y Chen הם מייסדים מדעיים ובעלי מניות של VasoRx, Inc. M Simons הוא חבר במועצה המדעית המייעצת של VasoRx, Inc. HJ Duckers הוא עובד ובעל מניות של VasoRx. המחברים האחרים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מיקרו-מענק של קונסורציום ביולוגיה משותף שניתן במסגרת מענק NIH P30AR070253 (PYC), קרן חינוך למחקר רפואי קרדיווסקולרי (PYC), VasoRx, Inc. Fund (MS) ומענקים של NIH HL135582 (MS), HL152197 (MS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-0 prolene suture pack Ethicon 8698G for incision closure
8-0 nylon suture pack AROSurgical Instruments T06A08N14-13 for ligation
Anesthesia induction chamber VETEQUIP #941444 Holds the animal during anesthesia exposure
Catheter Interface Cable PEC-4D Millar for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PCU-2000
Charcoal canister filters VETEQUIP #931401  to help remove waste anesthetic gases
Cotton swabs McKesson 24-106 for applying pressure to the injection site to prevent bleeding
Fine scissors Fine Science Tools 14059-11 Surgical tools
Insulin syringe 28 G EXEL 26027 for jugular vein IV injection
Isoflurane COVETRUS #029405 for mouse anesthesia
LabChart 8 Software ADInstruments for data analysis
Mikro-Tip Pressure Catheter SPR-1000 (1.0 F) Millar for invasive blood pressure measurement
Needle-25 G BD 305124 for making a samll hole in a vessel
Oxygen controller ProOx Oxygen Sensor BioSpherix E702 for oxygen concentration monitoring
PCU-2000 Pressure Control Unit Millar for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PowerLab 4/35
PowerLab 4/35 ADInstruments for Data Acquisition.
Investigator needs to connect the PowerLab 4/35 to a personal laptop containing LabChart 8 software for operation.
Prism 8 GraphPad for statistics and scientific graphing
Semisealable hypoxia chamber BioSpherix an artificial environment that simulates high-altitude conditions for animals
Spring Scissors Fine Science Tools 15021-15 Surgical tools
Tweezer Style 4 Electron Microscopy Sciences 0302-4-PO Surgical tools
VasoRx compound 7C1/let-7 miRNA VasoRx, Inc. Lot# B2-L-16Apr IV injection compound
VIP 3000 Veterinary Vaporizer COLONIAL MEDICAL SUPPLY CO., INC. for accurate anesthesia delivery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McLaughlin, V. V., McGoon, M. D. Pulmonary arterial hypertension. Circulation. 114 (1), 1417-1431 (2006).
  2. Hoeper, M. M., Humbert, M. The new haemodynamic definition of pulmonary hypertension: evidence prevails, finally. European Respiratory Journal. 53 (3), 1900038 (2019).
  3. Chen, Y., et al. A novel rat model of pulmonary hypertension induced by mono treatment with SU5416. Hypertension Research. 43 (8), 754-764 (2020).
  4. Xiong, M., et al. Mouse model of experimental pulmonary hypertension: Lung angiogram and right heart catheterization. Pulmonary Circulation. 11 (4), 20458940211041512 (2021).
  5. Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. Methods for intravenous self administration in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (70), e3739 (2012).
  6. Potus, F., Martin, A. Y., Snetsinger, B., Archer, S. L. Biventricular assessment of cardiac function and pressure-volume loops by closed-chest catheterization in mice. Journal of Visualized Experiments. (160), e61088 (2020).
  7. Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. The Sugen 5416/hypoxia mouse model of pulmonary arterial hypertension. Experimental Models of Cardiovascular Diseases. 1816, 243-252 (2018).
  8. Chen, P. Y., et al. FGF regulates TGF-beta signaling and endothelial-to-mesenchymal transition via control of let-7 miRNA expression. Cell Reports. 2 (6), 1684-1696 (2012).
  9. Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1 (9), 912-926 (2019).
  10. Daugherty, A., Rateri, D., Hong, L., Balakrishnan, A. Measuring blood pressure in mice using volume pressure recording, a tail-cuff method. Journal of Visualized Experiments. (27), e1291 (2009).
  11. Alam, M. A., Parks, C., Mancarella, S. Long-term blood pressure measurement in freely moving mice using telemetry. Journal of Visualized Experiments. (111), e53991 (2016).
  12. Luo, F., et al. Invasive hemodynamic assessment for the right ventricular system and hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension in mice. Journal of Visualized Experiments. (152), e60090 (2019).

Tags

מינון בולוס תוך ורידי הערכה המודינמית פולשנית מודל יתר לחץ דם עורקי ריאתי בעכבר הנגרם להיפוקסיה יתר לחץ דם עורקי ריאתי מחקר PAH טיפולים ניסיוניים וריד ג'וגולרי עכבר צנתור עורקים צנתור חדר ימין מודל PAH
מינון בולוס תוך ורידי מרובים והערכה המודינמית פולשנית במודל יתר לחץ דם של עורק ריאתי בעכבר הנגרם על ידי היפוקסיה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qin, L., Jiang, B., Zsebo, K.,… More

Qin, L., Jiang, B., Zsebo, K., Duckers, H. J., Simons, M., Chen, P. Y. Multiple Intravenous Bolus Dosing and Invasive Hemodynamic Assessment in a Hypoxia-Induced Mouse Pulmonary Artery Hypertension Model. J. Vis. Exp. (189), e63839, doi:10.3791/63839 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter