In vitro Untersuchung der Abtötung von Plasmodium-infizierten roten Blutkörperchen durch zytotoxische Lymphozyten

Summary

Hier beschreiben wir eine neue Methode, um die Mechanismen der zellulären Immunität gegen Plasmodien während der Blutphase der Infektion aufzuklären. Dabei handelt es sich um einen In-vitro-Assay , der die Abtötung infizierter roter Blutkörperchen durch zytotoxische Lymphozyten misst.

Abstract

Malaria ist mit mehr als 200 Millionen Fällen pro Jahr weltweit ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit. Trotz jahrelanger wissenschaftlicher Bemühungen ist die schützende Immunität gegen Malaria immer noch unzureichend verstanden, was vor allem auf methodische Einschränkungen der Langzeitkultur von Plasmodium, insbesondere für Plasmodium vivax, zurückzuführen ist. Die meisten Studien konzentrierten sich auf den adaptiven Immunschutz gegen Malaria durch Antikörper, die eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle von Malaria spielen. Der sterile Schutz, der durch abgeschwächte Plasmodium-Sporozoiten-Impfstoffe induziert wird, hängt jedoch mit der zellulären Reaktion zusammen, hauptsächlich mit zytotoxischen T-Lymphozyten wie CD8+ und gamma-delta-T-Zellen (γδ T). Daher müssen neue Methoden entwickelt werden, um die Funktionen der zellulären Immunantwort besser zu verstehen und so zukünftige Therapie- und Impfstoffentwicklungen zu unterstützen. Um eine neue Strategie zur Analyse dieser zellvermittelten Immunität gegen eine Infektion im Plasmodium-Blutstadium zu finden, hat unsere Gruppe einen In-vitro-Assay entwickelt, der die Abtötung infizierter roter Blutkörperchen (iRBC) durch zytotoxische Lymphozyten misst. Dieser Assay kann verwendet werden, um die Mechanismen der zellulären Immunantwort gegen verschiedene Plasmodium spp. im Blutstadium zu untersuchen. Angeborene und adaptive zytotoxische Immunzellen können iRBCs und den intrazellulären Parasiten in einem Effektor-Ziel-Mechanismus direkt eliminieren. Ziel-iRBCs werden markiert, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bewerten, und mit Effektorzellen (CD8⁺ T, γδ T, NK-Zellen usw.) kokultiviert. Der Lyseprozentsatz wird auf der Grundlage getesteter Bedingungen berechnet, verglichen mit einer spontanen Lysekontrolle in einem durchflusszytometrischen Assay. Letztendlich ist diese Methode des Abtötungstests ein großer Fortschritt im Verständnis der zellvermittelten Immunität gegen Malaria im Blutstadium, der dazu beiträgt, neue potenzielle therapeutische Ziele zu entdecken und die Entwicklung von Malariaimpfstoffen zu beschleunigen.

Introduction

Malaria ist nach wie vor eine globale Gesundheitskrise, mit mehr als 240 Millionen Fällen und 627.000 Todesfällen im Zusammenhang mit Malaria im Jahr 2020¹. Derzeit gibt es fünf parasitäre Arten, die beim Menschen Malaria verursachen können, von denen Plasmodium falciparum und Plasmodium vivax die beiden am weitesten verbreiteten Arten sind. Während einer Plasmodium-Infektion ist die Leber oder das präerythrozytäre Stadium asymptomatisch, und die Symptome treten nur während des asexuellen Zyklus des Parasiten im erythrozytären Stadium auf. In diesem Infektionsstadium werden Tausende von Merozoiten aus dem Leberstadium in den Blutkreislauf freigesetzt und infizieren rote Blutkörperchen (RBCs). Bei den Erythrozyten differenzieren sich die Parasiten durch Schizogonie in Trophozoiten und Schizonten, bis Schizonten die Erythrozyten aufbrechen und neu gebildete Merozoiten freisetzen, wodurch sich dieser Blutzyklus wiederholt. Wiederholte Zyklen von Invasion, Replikation und Merozoitenfreisetzung führen zu einem exponentiellen Wachstum der Parasitenpopulation und lösen schließlich Krankheitssymptome^{aus 2}.

Eine wichtige Herausforderung bei der Untersuchung der Immunantwort auf Malaria besteht darin, dass die Plasmodium spp. die den Menschen infiziert, infiziert keine Versuchstiermodelle. Daher müssen Plasmodium-infizierte Patientenproben frisch entnommen und sofort verarbeitet und analysiert werden. In Malaria-endemischen Gebieten sind die Ressourcen für den Zugang zu immunologischen und molekularen Mechanismen jedoch begrenzt. Aufgrund dieser Einschränkungen werden Nagetiere häufig als experimentelle Modelle verwendet, um die Immunantwort gegen eine Plasmodium-Infektion zu untersuchen. Während P. berghei und P. chabaudi häufig als Surrogate für eine P. falciparum-Infektion verwendet werden, weist der nicht-letale Stamm von P. yoelii 17XNL auch viele Gemeinsamkeiten mit P. vivax auf, wie z. B. eine retikulozyten-restriktive Infektion ^3,4. Die Entwicklung von Plasmodium-In-vitro-Assays, die für Proben aus menschlichen oder tierischen Modellen verwendet werden können, ist wertvoll, um die Pathogenese von Malaria besser zu verstehen und die immunologische Reaktion verschiedener Parasitenarten zu vergleichen.

Die schützende Immunität gegen Malaria ist weder im präerythrozytären noch im Blutstadium vollständig verstanden. Es ist bekannt, dass die Exposition gegenüber wiederholten Infektionen zu einer teilweise erworbenen Immunität führt, aber eine sterile Immunität wird selten entwickelt⁵. Jahrzehntelang war die Anti-Plasmodium-protektive Immunität hauptsächlich mit der Induktion von neutralisierenden oder opsonisierenden Antikörpern verbunden, die das Eindringen von Parasiten in Wirtszellen verhindern^{bzw. zu} einer Phagozytose durch antigenpräsentierende Zellen führen 6. Infolgedessen beruhten die meisten Bemühungen zur Herstellung von Malariaimpfstoffen bisher auf der Induktion schützender und lang anhaltender Antikörper ^7,8. Der sterile Schutz, der durch die Impfung mit einem abgeschwächten Sporozoiten induziert wird, korreliert jedoch direkt mit der Aktivierung und Expansion zytotoxischer T-Lymphozyten ^8,9.

In jüngster Zeit haben einige Studien an frisch isolierten Patientenproben und In-vitro-Kulturen gezeigt, dass angeborene oder adaptive zytotoxische Immunzellen wie CD8⁺ T¹⁰, γδ T 11 und NK-Zellen¹² Plasmodium-infizierte Erythrozyten und ihren intrazellulären Parasiten direkt in einem Effektor-Ziel-Verhältnis eliminieren können. Diese bahnbrechenden Erkenntnisse definierten einen völlig neuen Immuneffektor-Mechanismus im Zusammenhang mit Malaria. Um diese neuartige Antimalaria-Immunität zu entschlüsseln, ist es wichtig, zytotoxische Effektormechanismen von Killerzellen gegen infizierte Erythrozyten (iRBCs) bei einer natürlichen Infektion oder Impfung zu untersuchen.

Hier stellen wir einen in vitro Assay vor, der die zytotoxische Aktivität von Lymphozyten gegen Malaria im Blutstadium misst. Dieser Assay kann dann helfen, die Mechanismen der zellulären Immunantwort gegen das Plasmodium-Erythrozytenstadium aufzuklären. Die Zielzellen, iRBCs, werden mit Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE) markiert, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bewerten, und dann mit Effektorzellen wie zytotoxischen Lymphozyten (CTL) kokultiviert. Diese Kokultur wird dann durch Durchflusszytometrie unter Verwendung von Fluoreszenzmarkern für bestimmte Zelltypen bewertet. Schließlich wird der Prozentsatz der iRBC-Lyse durch CTL berechnet, indem die experimentelle Bedingung durch den spontanen Bruch der Erythrozyten und die spontane Lysekontrolle dividiert wird, die während der Inkubation ohne die Effektorzelle auftritt. Insgesamt kann diese Methode des Abtötungstests zu einem besseren Verständnis der zellvermittelten Malariaimmunität beitragen.

Protocol

Alle Verfahren wurden gemäß den Richtlinien der Oswaldo-Cruz-Stiftung und des Nationalen Ethikrats (CAAE: 59902816.7.0000.5091) durchgeführt. Die Humanprotokolle wurden in Zusammenarbeit mit der klinischen Forschungsgruppe des Forschungszentrums für Tropenmedizin von Rondônia (CEPEM) entwickelt, die für die Aufnahme von Patienten in die Studie zuständig war. Von allen Patienten wurde eine Einverständniserklärung eingeholt. Für die Tierstudie wurden die Verfahren nach den Verhaltensgr…

Representative Results

In dieser Arbeit wird die angewandte Methodik zur Isolierung von CFSE-markierten Plasmodium-infizierten Erythrozyten in einem Kokulturassay mit zytotoxischen Lymphozyten beschrieben. Zunächst stellen wir eine schematische Darstellung der Durchführung des Protokolls unter Verwendung von humanen Proben zur Verfügung, die mit P. vivax infiziert sind (Abbildung 1). Dann ein illustriertes Flussdiagramm zur Vorgehensweise mit dem Protokoll in einem experimentellen Malariamodel…

Discussion

Hier beschreiben wir einen in vitro Assay zur Messung der Abtötung von Plasmodium-infizierten roten Blutkörperchen durch zytotoxische Lymphozyten. Dieser Assay kann dazu beitragen, die Mechanismen der zellulären schützenden Immunität gegen das erythrozytäre Stadium des Malariaparasiten aufzuklären. Der Hauptvorteil dieser Methodik besteht darin, dass sie einen quantitativen Assay der zellvermittelten Abtötung von iRBCs liefert, der verwendet werden kann, um viele Fragen darüber zu beantworten, …

Materials

100 μM cell strainer	Corning	431752
96 Well Round (U) Bottom Plate	Thermo Scientific	12-565-65
Anti-human CD235a (Glycophorin A) Antibody	Biolegend	349114	Used – APC anti-human CD235, dilution 1:100
Anti-human CD3 Antibody	Biolegend	317314	Used – PB anti-human CD3, dilution 1:200
Anti-human CD8 Antibody	Biolegend	344714	Used – APC/Cy7 anti-human CD8, dilution 1:200
Anti-human TCR Vδ2 Antibody	Biolegend	331408	Used – PE anti-human TCR Vδ2, dilution 1:200
Anti-mouse CD8a Antibody	Biolegend	100733	Used- PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a, dilution 1:200
Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody	Biolegend	116223	Used – APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119, dilution 1:200
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit	Invitrogen	C34554
Fetal Bovine Serum, qualified	Gibco	26140079
Ficoll-Paque Plus	Cytiva	17144003	Lymphocyte Separation Medium (LSM)
Heparin Sodium Injection, USP	meithel pharma	71228-400-003	Used – 2000 USP units/2mL
Isoflurane	Piramal critical care	66794-0013-25
LS MACS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401
LSRFortessa Cell Analyzer	BD Bioscience
Percoll	Cytiva	17089101	Density Gradient Separation Medium (DGSM)
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875093
Sodium bicarbonate, powder,  BioReagent	Sigma-Aldrich	S5761
Syringe With Sub-Q needle – 1mL, 26 gauge;	BD	14-829-10F
Vacutainer Heparin Tube Glass Green 10 ml	BD	366480