Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento de BMM de ratas SD, llamado método de adherencia secundaria.
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Artículo de método
Aislamiento de células del linaje monocito-macrófago de huesos de rata por método de adherencia secundaria
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Con una disminución de la densidad mineral ósea, los huesos tienen más probabilidades de fracturarse, lo que afecta negativamente la calidad de vida de un paciente. El crecimiento y desarrollo de los huesos están regulados principalmente por osteoblastos y osteoclastos. Se ha aceptado ampliamente que los osteoclastos se derivan de las células de monocitos-macrófagos de la médula ósea (BMM). LosBMm y otras células madre hematopoyéticas se encuentran en la cavidad de la médula ósea. Por lo tanto, aislar BMM estables individuales de poblaciones celulares diferentes y heterogéneas es un gran desafío. Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento de BMM de ratas SD, llamado método de adherencia secundaria. Se recogieron células adherentes cultivadas durante 24-48 h en cultivo primario. El análisis citométrico de flujo mostró que aproximadamente el 37,94% de las células eran CD11b/c+ (antígeno de superficie monocito-macrófago). La tinción de fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) y el análisis de western blot demostraron que losBMM podían diferenciarse en osteoclastos in vitro. Los hallazgos anteriores sugirieron que las células de adherencia secundaria podrían considerarse como un modelo celular adecuado para la investigación de la diferenciación de osteoclastos.
Introducción
Se ha informado que las células del linaje monocitos-macrófagos existentes en la médula ósea pueden diferenciarse en monocitos sanguíneos y macrófagos tisulares 1,2. Las células anteriores, que pueden diferenciarse en osteoclastos para equilibrar el crecimiento y desarrollo óseo, se utilizan comúnmente como modelo celular para inducir osteoclastos in vivo 3,4. La médula ósea es un tejido especial que contiene varios tipos diferentes de células, que incluyen, entre otras, células madre mesenquimales de la médula ósea, célu....
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Protocolo
Todos los experimentos en este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas de experimentación con animales del Centro de Investigación de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica China de Zhejiang (Número de aprobación: IACUC-20181029-11).
1. Extracción celular
- Coloque a las ratas Sprague-Dawley (ratas SD, de 1 a 10 días de edad, macho o hembra) en las jaulas de eutanasia llenas de CO2 a una tasa equilibrada de 30% -70% de volumen / minuto del contenedor. Después de que las ratas pierden el conocimiento (20-60 min), eutanasia a la rata por dislocación cervical para asegurar una muerte i....
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Resultados
La población secundaria de células adherentes fue estable y uniforme. Con la proliferación celular continua, la mayoría de las células se hicieron más grandes, con forma irregular y crecieron en un disco adherente radial (Figura 2C, D). La citometría de flujo mostró que el porcentaje de células que expresan CD11b/c, un marcador molecular en la superficie de las células del linaje monocito-macrófago, fue de aproximadamente el 37,94% (
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Discusión
Los osteoclastos son uno de los tipos celulares más importantes involucrados en la aparición y desarrollo de enfermedades óseas, así como uno de los principales objetos de investigación de enfermedades óseas20. Los monocitos/macrófagos pueden diferenciarse en osteoclastos. Dado que los macrófagos mononucleares (células RAW264.7) son demasiado caros de comprar y se activan fácilmente durante el cultivo, es difícil realizar experimentos de diferenciación in vitro utilizando esta línea celul.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Zhejiang (subvención no. LY19H060001) y el Proyecto del Plan de Ciencia y Tecnología de Medicina Tradicional China de Zhejiang (no. 2022ZB093).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 35 mm2 rodajas trepadoras de células | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Anti-catepsina K | Abcam | ab19027 | 1:1.000 |
| Control de isotipo anti-CD11 | Abcam | ab172730 | 1 μ g/prueba,1.675 mg/Ml |
| Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μ g/prueba, 1 mg/mL |
| Anti-TRAP | Abcam ab191406 | 1:1.000 | |
| Anti-β-actina | Beyotime | AF5003 | 1:1.000 |
| Lonchas trepadoras de células | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Placa de cultivo celular | corning | 430167 | |
| Matraz de cultivo celular | corning | 430168 | |
| de águila modificado de Dulbecco (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Gibco | 10099141C | |
| IgG anticonejo de cabra Abcam | ab150077 | para IF, 1:2.000 | |
| anti-conejo de cabra IgG | Abcam | ab6721 | para WB, 1:2.000 |
| M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
| SD rata | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 días de edad | |
| SDS-PAGE kit de preparación de gel | Solarbio | P1200 | |
| TRAP/ALP kit de tinción | Wako | 294-67001 | |
| Solución de tripsina-EDTA | Biosharp | BL512A | |
| solución Wright-Giemsa | Keygen Biotech | KGA225-1 |
Referencias
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).
- Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity.....
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Reimpresiones y permisos
