JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Traducción Automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociencias

Tüm Beyin Tek Hücreli Görüntüleme ve MRG, Doku Temizleme ve Işık Tabakası Mikroskobu Kullanarak Bozulmamış Yenidoğan Fare Beyinlerinin Analizi

Published: August 01, 2022
doi:
10.3791/64096
, , , , , , , , , , ,
1UNC Neuroscience Center,University of North Carolina, Chapel Hill, 2Department of Genetics,University of North Carolina, Chapel Hill, 3Department of Psychiatry,University of North Carolina, Chapel Hill, 4Center for Animal Magnetic Resonance Imaging,The University of North Carolina at Chapel Hill, 5Biomedical Research Imaging Center,The University of North Carolina at Chapel Hill, 6Department of Neurology,The University of North Carolina at Chapel Hill, 7Department of Computer Science,The University of North Carolina at Greensboro

Summary

Bu protokol, iDISCO + kullanarak bozulmamış fare beyinlerinin manyetik rezonans görüntüleme, temizleme ve immünoetiketleme yöntemlerini açıklar, ardından ışık tabakası mikroskobu kullanılarak görüntülemenin ayrıntılı bir açıklaması ve NuMorph kullanılarak aşağı akış analizleri yapılır.

Abstract

Doku temizlemenin ardından ışık tabakası mikroskobu (LSFM), bozulmamış beyin yapısının hücresel çözünürlüklü görüntülenmesini sağlayarak genetik veya çevresel bozulmaların neden olduğu yapısal değişikliklerin nicel analizine izin verir. Tüm beyin görüntülemesi, hücrelerin daha doğru bir şekilde ölçülmesi ve fiziksel olarak kesitlenmiş dokunun yaygın olarak kullanılan mikroskopisi ile gözden kaçırılabilecek bölgeye özgü farklılıkların incelenmesi ile sonuçlanır. Temizlenmiş beyinleri görüntülemek için ışık tabakası mikroskobu kullanmak, konfokal mikroskopiye kıyasla edinme hızını büyük ölçüde artırır. Bu görüntüler çok büyük miktarlarda beyin yapısal verisi üretmesine rağmen, temizlenmiş doku görüntülerinde özellik ölçümü yapan çoğu hesaplama aracı, tüm çekirdeklerden ziyade seyrek hücre popülasyonlarını saymakla sınırlıdır.

Burada, bir ışık tabakası mikroskobunda temizlendikten ve görüntülendikten sonra, doğum sonrası 4. gün (P4) fare beyninin açıklamalı bölgelerindeki tüm çekirdekleri ve nükleer belirteçleri ölçmek için bir grup analiz aracı olan NuMorph’u (Nükleer Tabanlı Morfometri) gösteriyoruz. Doku temizleme dehidrasyon adımlarının neden olduğu büzülmeden önce beyin hacmini ölçmek için manyetik rezonans görüntülemeyi (MRG), immünoetiketleme de dahil olmak üzere iDISCO + yöntemini kullanarak doku temizlemeyi ve ardından fare beyinlerini hücresel çözünürlükte görüntülemek için ticari olarak temin edilebilen bir platform kullanarak ışık tabakası mikroskobu kullanıyoruz. Daha sonra, yoğunluk farklılıklarını düzeltmek, görüntü döşemelerini dikmek, birden fazla kanalı hizalamak, çekirdekleri saymak ve genel kullanıma açık atlaslara kayıt yoluyla beyin bölgelerine açıklama eklemek için kullanılan NuMorph’u kullanarak bu görüntü analizi işlem hattını gösteriyoruz.

Bu yaklaşımı, gerekli mikroskop ve hesaplama kaynaklarına sahip herhangi bir araştırmacının bu teknikleri gerçekleştirmesine izin veren halka açık protokolleri ve yazılımları kullanarak tasarladık. Bu doku temizleme, görüntüleme ve hesaplama araçları, korteksteki hücre tiplerinin üç boyutlu (3B) organizasyonunun ölçülmesine ve nicelleştirilmesine izin verir ve herhangi bir vahşi tip / nakavt fare çalışması tasarımına yaygın olarak uygulanmalıdır.

Introduction

Tek hücreli çözünürlükte tüm beyin görüntüleme, nörobilimde önemli bir zorluktur. Hücresel çözünürlüklü beyin görüntüleri, beyin devresinin ayrıntılı analizine ve sistem düzeyinde haritalandırılmasına ve bu devrenin nöropsikiyatrik bozukluklar için genetik veya çevresel risk faktörleri, gelişmekte olan embriyolardaki hücresel davranış ve yetişkin beynindeki nöral devreler tarafından nasıl bozulduğuna izin verir 1,2,3. Yeniden yapılandırılmış 3D beynin yüksek çözünürlüklü görüntülerine izin veren birden fazla histolojik yöntem vardır; Bununla birlikte, bu teknikler pahalı, özel ekipman gerektirir, immünoetiketleme ile uyumlu olmayabilir ve bazı yöntemlerin iki boyutlu (2D) doğası, 4,5 kesiti sırasında doku hasarına ve kesmeye neden olabilir.

Son gelişmeler, doku kesiti gerektirmeyen tüm beyinleri görüntülemek için alternatif bir yaklaşım sağlamıştır; beyinleri şeffaf hale getirmek için doku temizlemeyi kullanmayı içerirler. Çoğu doku temizleme yönteminde şeffaflık, hem ışık saçılmasının önemli bir kaynağı oldukları için lipitlerin çıkarılması hem de görüntüleme sırasında nesnenin kırılma indisinin (RI) numune daldırma çözeltisinin RI ile eşleştirilmesi ile sağlanır. Işık daha sonradağılmadan malzemeler arasındaki sınırdan geçebilir 6,7,8,9.

İDISCO+ gibi doku temizleme yöntemleri genellikle LSFM 6,7,10 gibi tek foton uyarma mikroskobu kullanılarak hızlı 3D görüntüleme ile birleştirilir. Florofor ile etiketlenmiş şeffaf dokular içinde, ışık tabakası floresan mikroskopi, ince bir ışık düzlemi ile uyarılarak bölümlerhalinde görüntülenir 11. LSFM’nin temel avantajı, bir seferde tek bir optik bölümün aydınlatılması, bu bölümdeki moleküllerden gelen tüm floresanların uyarılması ve bu da fotobeyazlatmayı en aza indirmesidir. Dahası, tüm optik dilimin görüntülenmesi, bu heyecanlı dilimin kamera tabanlı algılanmasını sağlayarak nokta tarama12’ye göre hızı artırır. LSFM, tahribatsız bir şekilde, 3D rekonstrüksiyon için uygun olan iyi kaydedilmiş optik bölümler üretir.

iDISCO + yöntemi ~ 3 hafta içinde ucuz doku temizlemeye izin verirken, protokoldeki dehidrasyon adımları doku büzülmesine ve numune morfolojisinin potansiyel olarak değişmesine neden olabilir, böylece hacimsel ölçümleri etkileyebilir 6,10. Doku temizleme prosedüründen önce kullanılacak MRI gibi ikincil bir görüntüleme yönteminin eklenmesi, numune boyunca doku temizlemeye bağlı büzülme derecesini ölçebilir. Dehidrasyon aşamaları sırasında, gri ve beyaz cevher arasındaki mekanik özelliklerdeki farklılıklar, düzgün olmayan beyin maddesi deformasyonlarına yol açabilir, bu da vahşi tip ve mutant numuneler arasında farklı doku temizlemeye bağlı hacim deformasyonlarına neden olabilir ve bu numunelerdeki hacimsel farklılıkların yorumlarını karıştırabilir10,13 . MRG, ilk önce hayvanı bir kontrast madde (örneğin, gadolinyum) ile perfüze ederek, ardından görüntüleme14’ten önce ekstrakte edilen dokuyu bir daldırma çözeltisinde (örneğin, fomblin) inkübe ederek gerçekleştirilir. MRG, doku temizleme ve aynı numune üzerinde LSFM yapılması ile uyumludur.

LSFM genellikle beyin yapısının nicel olarak değerlendirilmesinden ziyade, ilgilenilen beyin dokusunun kalitatif görselleştirmesi için büyük ölçekli mikroskopi görüntüleri oluşturmak için kullanılır (Şekil 1). Nicel değerlendirme olmadan, genetik veya çevresel hakaretlerden kaynaklanan yapısal farklılıkları göstermek zordur. Doku temizleme ve görüntüleme teknolojileri geliştikçe, depolama ve hesaplama gücünün maliyetlerinin azalmasıyla birlikte, ilgilenilen doku içindeki hücre tipi lokalizasyonlarını ölçmek daha erişilebilir hale geliyor ve daha fazla araştırmacının bu verileri çalışmalarına dahil etmesine izin veriyor.

Fare beynindeki 100 milyondan fazla hücre15 ve terabaytlarca veri üretebilen tüm beyin görüntüleme oturumlarıyla, hücreler gibi görüntülerdeki özelliklerin doğru bir şekilde ölçülmesini sağlayan gelişmiş görüntü analiz araçlarına olan talep artmaktadır. Nükleer boyama yoğunluğu için eşik uygulayan ve önceden tanımlanmış şekil, boyut veya yoğunluklara sahip nesneleri filtreleyen doku temizlenmiş görüntüler için bir dizi segmentasyon yöntemi mevcuttur10,16,17,18. Bununla birlikte, sonuçların yanlış yorumlanması, hücre boyutu, görüntü kontrastı ve etiketleme yoğunluğu gibi parametrelerdeki değişikliklerden kaynaklanabilir. Bu makale, fare beynindeki hücre çekirdeklerini ölçmek için kurulan protokolümüzü açıklamaktadır. İlk olarak, P4 fare beyninin doku toplanması için adımları detaylandırıyoruz, ardından halka açık iDISCO+ yöntem10’dan optimize edilmiş bir doku temizleme ve immünoetiketleme protokolü izliyoruz. İkincisi, görüntü yakalama için kullanılan parametreler de dahil olmak üzere MRI ve ışık tabakası mikroskobu kullanarak görüntü yakalamayı açıklıyoruz. Son olarak, grubumuzun geliştirdiği, doku temizleme, nükleer belirteçlerle immünoetiketleme ve açıklamalı bölgelerin ışık tabakası görüntülemesinden sonra hücre tipine özgü nicelleştirmeye izin veren bir dizi görüntü analiz aracı olan NuMorph19’u tanımlıyoruz ve gösteriyoruz.

Protocol

Tüm fareler, Chapel Hill’deki Kuzey Carolina Üniversitesi’ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi’ne (IACUC) uygun olarak kullanılmış ve onaylanmıştır. 1. Fare diseksiyonu ve perfüzyonu NOT: Aşağıdaki diseksiyonlar P4 ve P14 farelerde bir şırınga kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Perfüzyon sıvısının hacmi, hayvanın yaşına bağlı olarak değişecektir. PerfüzyonDİKKAT: Paraformaldehit (PFA) te…

Representative Results

iDISCO+ protokolü, gözle kolayca fark edilebilen önemli doku büzülmesini beraberinde getirdiğinden (Şekil 2B), doku temizlemenin neden olduğu büzülmeyi ölçmek için doku temizlemeden önce bu boru hattına bir MRI adımı ekledik. İş akışı, beyin dışı dokunun MR görüntüsünden çıkarılmasıyla başlar (Şekil 2C). Daha sonra, MR görüntüsünü ışık tabakası görüntüsüne hizalamak için katı bir dönüşüm (3 çeviri ve 3 dön?…

Discussion

Doku temizleme yöntemleri, beynin 3D hücresel organizasyonunu ölçmek için yararlı tekniklerdir. Literatürde tanımlanan ve her biri avantajları ve sınırlamaları olan bir dizi doku temizleme yöntemi vardır 6,7,8,9. Doku temizlenmiş görüntülerdeki hücre tiplerini analiz etmek için hesaplama araçlarının seçenekleri nispeten sınırlıdır. Segmentasyonun daha az zor olduğu …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma NIH (R01MH121433, R01MH118349 ve R01MH120125 JLS’ye ve R01NS110791’den GW’ye) ve Umut Vakfı tarafından desteklenmiştir. Mikroskopi Hizmetleri Laboratuvarı’ndan Pablo Ariel’e örnek görüntülemeye yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Patoloji ve Laboratuvar Tıbbı Anabilim Dalı’ndaki Mikroskopi Hizmetleri Laboratuvarı, kısmen Kuzey Carolina Üniversitesi (UNC) Lineberger Kapsamlı Kanser Merkezi’ne Kanser Merkezi Çekirdek Destek Hibe P30 CA016086 tarafından desteklenmektedir. Nörobilim Mikroskopi Çekirdeği, hibe P30 NS045892 tarafından desteklenmektedir. Bu yayında bildirilen araştırmalar kısmen Kuzey Carolina Biyoteknoloji Merkezi Kurumsal Destek Hibe 2016-IDG-1016 tarafından desteklenmiştir.

Materials

Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner Bruker Biospec Horizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl ether Sigma-Aldrich 108014-1KG
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich 270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher-Scientific ICN19605590
Donkey serum Sigma-Aldrich S30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin Y Speciality Fluids Company YL-VAC-25-6 perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance) Bracco Diagnostics A9576
gadolinium contrast agent(ProHance) Bracco Diagnostics 0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU EVGA 08G-P4-6286-KR
Glycine Sigma-Aldrich G7126-500G
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3393-10KU Dissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30% Sigma-Aldrich H1009-100ML
ImSpector Pro LaVision BioTec Microscope image acquisition software
ITK Snap segmentation software
Methanol Fisher-Scientific A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective Olympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA) Sigma-Aldrich 30525-89-4 Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) Corning 46-013-CM Diluted to 1x in H2O
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002-100G Dissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-10G
Tergitol type NP-40 Sigma-Aldrich NP40S-100ML
TritonX-100 Sigma-Aldrich T8787-50ML
Tween-20 Fisher-Scientific BP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope LaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4 Intel E5-2690
Zyla sCMOS Camera Andor Complementary metal oxide semiconductor camera
Antibody Working concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit Thermofisher Scientific A11369 (1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat Thermofisher Scientific A11077 (1:200)
Rat anti-Ctip2 Abcam ab18465 (1:400)
Rabbit anti-Brn2 Cell Signaling Technology 12137 (1:100)
To-Pro 3 (TP3) Thermofisher Scientific T3605 (1:400)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  2. Hägerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).
  3. Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 558-565 (2011).
  4. Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).
  5. Stoner, R., et al. Patches of disorganization in the neocortex of children with autism. The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).
  6. Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  7. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  8. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
  9. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  10. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  11. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).
  12. Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
  13. Budday, S., et al. Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).
  14. Johnson, G. A., et al. High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology. NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).
  15. Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).
  16. Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
  17. Fürth, D., et al. An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution. Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).
  18. Chandrashekhar, V., et al. CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration. Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).
  19. Krupa, O., et al. NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images. Cell Reports. 37 (2), 109802 (2021).
  20. Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. Models of neurodegenerative disease – Alzheimer’s anatomical and amyloid plaque imaging. Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).
  21. Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. FSL. NeuroImage. 62, 782-790 (2012).
  22. Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images. NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).
  23. Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain. Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).
  24. . iDISCO method Available from: https://idisco.info/ (2022)
  25. Ariel, P. UltraMicroscope II – A User Guide. University of North Carolina at Chapel Hill. , (2019).
  26. . Anaconda Distribution – Anaconda documentation Available from: https://docs.anaconda.com/anaconda/ (2022)
  27. Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Communications. 8, 14836 (2017).
  28. Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).
  29. Lowe, G. Sift-the scale invariant feature transform. International Journal. 2 (91-110), 2 (2004).
  30. Young, D. M., et al. Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper. Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), 104 (2020).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Velíšek, L. Under the (Light) sheet after the iDISCO. Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).
  33. Young, D. M., et al. Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain. eLife. 10, (2021).
  34. Yun, D. H., et al. Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping. bioRxiv. , (2019).
  35. Silvestri, L., et al. Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains. Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).
  36. Frasconi, P., et al. Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images. Bioinformatics. 30 (17), 587 (2014).
  37. Kruskal, J. B. On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem. Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).
  38. Wang, Q., et al. The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas. Cell. 181, 936-953 (2020).
  39. Borland, D., et al. Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations. BMC Bioinformatics. 22 (1), 260 (2021).
  40. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).

Tags

Whole-brainSingle-cellImagingAnalysisIntactNeonatalMouseBrainMRILight-sheet MicroscopyImage AnalysisNuclei QuantificationComputational PipelinePreprocessingCell DetectionImaging TimeComputational ResourcesSample MountingSample OrientationZoom MagnificationLight SheetNumerical ApertureDynamic FocusingLaser PowerLight Sheet WidthTile OverlapCondaNuMorphMATLABImage ProcessingIntensity Adjustment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Kyere, F. A., Curtin, I., Krupa, O., McCormick, C. M., Dere, M., Khan, S., Kim, M., Wang, T. W., He, Q., Wu, G., Shih, Y. I., Stein, J. L. Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (186), e64096, doi:10.3791/64096 (2022).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image