Despolarización selectiva asistida por microfluídica de mitocondrias axonales

Resumen

El presente protocolo describe la siembra y tinción de mitocondrias neuronales en cámaras microfluídicas. El gradiente de presión fluídica en estas cámaras permite el tratamiento selectivo de las mitocondrias en los axones para analizar sus propiedades en respuesta a desafíos farmacológicos sin afectar el compartimento del cuerpo celular.

Resumen

Las mitocondrias son los principales proveedores de ATP (trifosfato de adenosina) en las neuronas. La disfunción mitocondrial es un fenotipo común en muchas enfermedades neurodegenerativas. Dada la elaborada arquitectura y la longitud extrema de algunos axones, no es sorprendente que las mitocondrias en los axones puedan experimentar diferentes entornos en comparación con sus contrapartes del cuerpo celular. Curiosamente, la disfunción de las mitocondrias axonales a menudo precede a los efectos en el cuerpo celular. Para modelar la disfunción mitocondrial axonal in vitro, los dispositivos microfluídicos permiten el tratamiento de las mitocondrias axonales sin afectar a las mitocondrias somales. El gradiente de presión fluídica en estas cámaras evita la difusión de moléculas contra el gradiente, lo que permite el análisis de las propiedades mitocondriales en respuesta a los desafíos farmacológicos locales dentro de los axones. El protocolo actual describe la siembra de neuronas disociadas del hipocampo en dispositivos microfluídicos, la tinción con un tinte sensible al potencial de membrana, el tratamiento con una toxina mitocondrial y el posterior análisis microscópico. Este método versátil para estudiar la biología axonal se puede aplicar a muchas perturbaciones farmacológicas y lecturas de imágenes, y es adecuado para varios subtipos neuronales.

Introducción

Las mitocondrias son los principales proveedores de ATP (trifosfato de adenosina) en las neuronas. Como la salud neuronal está íntimamente ligada a la función mitocondrial, no es sorprendente que la regulación disfuncional de estos orgánulos se haya asociado con la aparición de diversas enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Parkinson¹. Además, la intoxicación mitocondrial se ha utilizado con éxito para modelar los síntomas parkinsonianos en animales². Tanto en modelos animales como en enfermedades humanas, la desaparición de las neuronas comienza en las partes distales

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron siguiendo las directrices y reglamentos pertinentes del Gobierno de Alta Baviera. Las neuronas primarias se prepararon a partir de embriones de ratón de tipo salvaje E16.5 C57BL / 6 de ambos sexos siguiendo los métodos estándar descritos anteriormente⁶.

1. Montaje del dispositivo microfluídico

1. Cubra una placa de cultivo de tejido con fondo de vidrio de seis pocillos con una concentración final de 20 μg/ml de poli-D-lisina y 3,4 μg/ml de laminina en PBS (solución salina tamponada con fosfato) (consulte la Tabla de materiales)....

Resultados

Las neuronas primarias del hipocampo se cultivaron en dispositivos microfluídicos durante 7-8 días antes de que las mitocondrias se tiñeran con el tinte sensible a la membrana (TMRE) durante 25 minutos en ambos canales. Como se muestra en la Figura 2A, esto produjo una tinción homogénea de las mitocondrias en ambos lados de los microsurcos, pero fue insuficiente para equilibrar la tinción en el medio de los microsurcos. Tras la adición de antimicina A al lado axonal, las mitocondrias somales.......

Discusión

El presente protocolo describe un método para sembrar y cultivar neuronas disociadas del hipocampo en un dispositivo microfluídico para tratar las mitocondrias axonales por separado. La utilidad de este enfoque con el colorante sensible a la membrana TMRE y el inhibidor del complejo III Antimicina A (como se demostró anteriormente⁷) se demuestra aquí, pero este método puede adaptarse fácilmente a otros colorantes mitocondriales o sensores codificados genéticamente de funciones mitocondriales que p.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa inferior de vidrio de 6 pocillos	Cellvis	P06.1.5H-N Dispositivo de	silicona
Antimicina A	Sigma	A8674
B27	Gibco	17504044
EVOS M5000 microscopio de campo amplio	Thermofischer Scientific	EVOS M5000	microscopio digital de campo amplio totalmente integrado
Hibernate E	BrainBits	HE500
Disco giratorio invertido confocal	Nikon	TI2-E + CSU-W1	Con cámara de incubación
Laminin	Invitrogen	L2020
Dispositivos microfluídicos	XONA microfluídica	RD450
Medio neurobasal	Gibco	21103049
Poly-D-Lisine	Sigma	P2636
TMRE	Sigma	87917