Muchos genes regulados al alza estimulan la migración y la invasión de las células tumorales, lo que lleva a un mal pronóstico. Es fundamental determinar qué genes regulan la migración y la invasión de las células tumorales. Este protocolo presenta un método para investigar los efectos del aumento de la expresión de un gen en la migración e invasión de células tumorales en tiempo real.
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Artículo de método
Medición cuantitativa en tiempo real de la migración e invasión de células tumorales después de la transfección de ARNm sintético
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células tumorales son altamente móviles e invasivas y muestran patrones de expresión génica alterados. El conocimiento de cómo los cambios en la expresión génica regulan la migración e invasión de células tumorales es esencial para comprender los mecanismos de infiltración de células tumorales en los tejidos sanos vecinos y la metástasis. Anteriormente, se demostró que la eliminación de genes seguida de la medición en tiempo real basada en impedancia de la migración e invasión de células tumorales permite la identificación de los genes necesarios para la migración e invasión de células tumorales. Recientemente, las vacunas de ARNm contra el SARS-CoV-2 han aumentado el interés en el uso de ARNm sintético con fines terapéuticos. Aquí, se revisó el método que utiliza ARNm sintético para estudiar el efecto de la sobreexpresión génica en la migración e invasión de células tumorales. Este estudio demuestra que la expresión génica elevada con transfección sintética de ARNm seguida de una medición en tiempo real basada en impedancia puede ayudar a identificar los genes que estimulan la migración e invasión de células tumorales. Este artículo sobre el método proporciona detalles importantes sobre los procedimientos para examinar el efecto de la expresión génica alterada en la migración e invasión de células tumorales.
Introducción
La motilidad de las células tumorales juega un papel crucial en la metástasis 1,2. La diseminación de las células tumorales a los tejidos sanos vecinos y remotos dificulta el tratamiento del cáncer y contribuye a la recurrencia 3,4. Por lo tanto, es esencial comprender los mecanismos de motilidad de las células tumorales y desarrollar estrategias terapéuticas relevantes. Dado que muchas células tumorales tienen perfiles de expresión génica alterados, es crucial comprender qué cambios en el perfil de expresión génica conducen a una motilidad alterada de....
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Protocolo
1. Síntesis de ARNm
NOTA: Para la síntesis de ARNm, todos los reactivos y equipos deben ser tratados especialmente para inactivar las ARNasas antes de su uso. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, instrumentos y reactivos utilizados en este protocolo.
- Linealización del ADN
NOTA: Los ADNc de ratón de CrkI y CrkL se clonaron en el vector de expresión pFLAG-CMV-5a para añadir la etiqueta de epítopo FLAG en el extremo C-terminal y se subclonaron en el vector pcDNA3.1/myc-His para incorporar el promotor T7, como se ha descrito an....
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Resultados
Las proteínas Crk y CrkL desempeñan un papel importante en la motilidad de muchos tipos de células, incluidas las neuronas22, las células T23, los fibroblastos 18,19 y una variedad de células tumorales13. Dado que se ha descrito que las proteínas Crk y CrkL están elevadas en el glioblastoma24,25,26, en este trabajo se estudiaron los efectos de la sobreexpresión de CrkI.......
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Discusión
La migración y la invasión son características importantes de las células tumorales. La medición de la motilidad de las células tumorales y la comprensión del mecanismo subyacente que controla la motilidad de las células tumorales proporcionan información crítica sobre las intervenciones terapéuticas 2,27. Se han desarrollado varios métodos para estudiar la migración celular7. El ensayo de cicatrización de heridas mediante arañazos o inser.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Centro de Redacción Médica de Children's Mercy Kansas City por editar este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la Fundación A.R.T. de Natalie (a T.P.) y por una subvención de la Junta Asesora de Socios de MCA del Children's Mercy Hospital (CMH) y el Centro Oncológico de la Universidad de Kansas (KUCC) (a T.P.).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| AlphaImager HP | ProteinSimple | 92-13823-00 Sistema de | imagen en gel de agarosa |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T9026 | Se utiliza para detectar α-proteína tubulina (dilución 1:3.000) |
| CIM-plate 16 | Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Placas de invasión y migración celular |
| Crk anticuerpo | BD Biosciences | 610035 | Se utiliza para detectar proteínas CrkI y CrkII (dilución 1:1.500) |
| Anticuerpo CrkL | Santa Cruz | sc-319 | Se utiliza para detectar proteínas CrkL (dilución 1:1.500) |
| Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio (DMEM) | ATCC | 302002 Medio de cultivo celular | |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) | Corning | 21-031-CV | Tampón utilizado para lavar las células |
| Suero fetal bovino (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | Suplemento de medio de cultivo |
| Heracell VIOS 160i Incubadora de CO2 | Thermo Scientific | 51030285 | Incubadora de CO2 |
| IRDye 800CW cabra anticuerpo secundario IgG contra el ratón | Li-Cor | 926-32210 | Anticuerpo secundario para el análisis de Western blot (dilución 1:10.000) |
| IRDye 800CW anticuerpo secundario IgG anti-conejo de cabra | Li-Cor | 926-32211 | Anticuerpo secundario para el análisis de Western blot (dilución 1:10.000) |
| Cloruro de litio | Invitrogen | AM9480 | Utilizado para la precipitación de ARN |
| Matriz Matrigel | Corning | 354234 | Gel de matriz extracelular (ECM) |
| Kit de transcripción MEGAscript T7 | Invitrogen | AM1334 | Utilizado para la síntesis de ARN |
| Marcadores de ARN Millennium | Invitrogen | AM7150 | Utilizado para la electroforesis en gel de formaldehído y agarosa |
| Mini centrífuga | ISC BioExpress | C1301P-ISC | Se utiliza para centrifugar células |
| Cerebro de ratón QUICK-Clone ADNc | TaKaRa | 637301 | Fuente de genes (insertos) para la clonación |
| NanoQuant | Tecan | M200PRO | Sistema de cuantificación de ácidos nucleicos |
| Sistema de electroporación de neón | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Sistema de electroporación1 |
| Sistema de transfección de neón 10 µ L kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Kit de electroporación |
| Sistema de transfección de neón 100 µ L kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | Kit de electroporación |
| NorthernMax tampón de gel desnaturalizante | Invitrogen | AM8676 | Se utiliza para la electroforesis de gel de formaldehído |
| y agarosa NorthernMax colorante de carga de formaldehído | Invitrogen | AM8552 | Se utiliza para la electroforesis de gel de agarosa con formaldehído |
| NorthernMax Tampón de ejecución | Invitrogen | AM8671 | Se utiliza para la electroforesis en gel de agarosa con formaldehído |
| Agua libre de nucleasas | Teknova | W3331 | Se utiliza para diversas reacciones durante la síntesis de ARNm |
| Odyssey CLx Imager | Li-Cor | Imager para el análisis de Western blot | |
| pcDNA3.1/myc-His | Invitrogen | V80020 | El vector en el que se clonaron las inserciones (CrkI de ratón y CrkL cDNAs) |
| pFLAG-CMV-5a | Millipore Sigma | E7523 | Fuente de la etiqueta epítopo FLAG |
| Fenol: cloroformo: alcohol isoamílico | Sigma | P2069 | Utilizado para la extracción de ADN |
| PmeI | New England BioLabs | R0560L | Utilizado para linealizar los plásmidos para la síntesis de ARNm |
| Kit de relaves Poly(A) | Invitrogen | AM1350 | Utilizado para la reacción de cola de poli(A) |
| Placa de cultivo de tejidos de poliestireno (estilo de 100 x 20 mm) | Corning | 353003 Utilizado para cultivar células antes de la | |
| transfecciónPlaca de cultivo de tejidos de poliestireno (estilo 35 x 10 mm) | Corning | 353001 | Se utiliza para el cultivo de células transfectadas |
| Proteinasa K | Invitrogen | 25530049 | Se utiliza para eliminar proteínas en la mezcla de reacción |
| Purificador Axiom Clase II, Tipo C1 | Labconco Corporation | 304410001 | Cabina de bioseguridad para la manipulación estéril de células |
| Tampón de resuspensión R | ThermoFisher Scientific | Un tampón incluido en los kits de electroporación, MPK1025 y MPK10096. El tampón se utiliza para reabastecer las células antes de la electroporación, y su composición es información patentada. | |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | Solución de descontaminación de ARN |
| Scepter | Millipore | C85360 | Contador de células automatizado de mano |
| Kit de 2'-O-metiltransferasa ScriptCap | C-SCMT0625 | Se utiliza para la reacción de taponado | |
| Sistema de taponado ScriptCap m7G | Cellscript | C-SCCE0625 | Se utiliza para la reacción de taponado |
| Solución de dodecil sulfato de sodio | Invitrogen | 15553-035 | Detergente utilizado para la reacción de la proteinasa K |
| Centrífuga Sorvall Legend XT | Thermo Scientific | 75004532 | Centrífuga de sobremesa para centrifugar células |
| Tripsina-EDTA | Gibco | 25300-054 | Se utiliza para la disociación de células |
| U-118MG | ATCC | HTB15 | Una línea celular adherente derivada de un paciente con glioblastoma humano |
| Anticuerpo de vinculina | Sigma | V9131 | Utilizado para detectar la proteína vinculina (dilución 1:100.000) |
| xCELLigence RTCA DP | Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrumento utilizado para el análisis |
| de células en tiempo real1Los parámetros de electroporación y otra información relacionada para varias líneas celulares están disponibles en la página de inicio del fabricante (¿https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?). |
Referencias
- Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. Targeting tumor cell motility to prevent metastasis. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in....
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Reimpresiones y permisos
