Isolamento e quantificação do vírus Epstein-Barr a partir da linhagem celular P3HR1

Summary

Este protocolo permite o isolamento de partículas do vírus Epstein-Barr da linhagem celular humana P3HR1 ao induzir o ciclo lítico viral com 12-miristato de forbol 13-acetato. O DNA é subsequentemente extraído da preparação viral e submetido a PCR em tempo real para quantificar a concentração de partículas virais.

Abstract

O vírus Epstein-Barr (EBV), formalmente designado como herpesvírus humano 4 (HHV-4), é o primeiro vírus tumoral humano isolado. Quase 90-95% da população adulta do mundo está infectada pelo EBV. Com os recentes avanços em biologia molecular e imunologia, a aplicação de modelos experimentais in vitro e in vivo forneceu uma visão profunda e significativa da patogênese do EBV em muitas doenças, bem como da tumorigênese associada ao EBV. O objetivo deste trabalho experimental visualizado é fornecer uma visão geral do isolamento de partículas virais de EBV de células da linhagem celular P3HR1, seguido de quantificação da preparação viral. As células P3HR1, originalmente isoladas de um linfoma de Burkitt humano, podem produzir um vírus P3HR1, que é uma cepa de EBV tipo 2. O ciclo lítico do EBV pode ser induzido nessas células P3HR1 pelo tratamento com 12-miristato de forbol 13-acetato (PMA), produzindo partículas virais de EBV.

Usando este protocolo para o isolamento de partículas de EBV, as células P3HR1 são cultivadas por 5 dias a 37 °C e 5% de CO₂ em meio completo RPMI-1640 contendo 35 ng/mL de PMA. Posteriormente, o meio de cultura é centrifugado a uma velocidade de 120 x g por 8 min para peletizar as células. O sobrenadante contendo vírus é então coletado e girado a uma velocidade de 16.000 x g por 90 min para pellet as partículas de EBV. O pellet viral é então ressuspenso em um meio RPMI-1640 completo. Isto é seguido por extração de DNA e PCR quantitativa em tempo real para avaliar a concentração de partículas de EBV na preparação.

Introduction

O vírus Epstein-Barr (EBV) é o primeiro vírus tumoral humano a ser isolado¹. O EBV, formalmente referido como herpesvírus humano 4 (HHV-4)², faz parte da subfamília do vírus do herpes gama da família do vírus do herpes e é o protótipo do gênero Lymphocryptovirus . Quase 90-95% da população adulta do mundo está infectada pelo vírus³. Na maioria dos casos, a infecção inicial ocorre nos primeiros 3 anos de vida e é assintomática, no entanto, se a infecção ocorrer mais tarde durante a adolescência, pode dar origem a uma doença referida como mononucleose infecciosa⁴. O EBV é capaz de infectar células B em repouso, induzindo-as a se tornarem linfoblastos B proliferativos nos quais o vírus estabelece e mantém um estado de infecção latente⁵. O EBV pode ser reativado a qualquer momento e, assim, levar a infecções recorrentes⁶.

Nos últimos 50 anos, a associação entre alguns vírus e o desenvolvimento de malignidades humanas tornou-se cada vez mais evidente, e hoje estima-se que 15% a 20% de todos os cânceres humanos estejam relacionados a infecções virais⁷. Os vírus do herpes, incluindo o EBV, são alguns dos exemplos mais bem estudados desses tipos de vírus tumorais⁸. De fato, o EBV pode causar muitos tipos de neoplasias malignas humanas, como linfoma de Burkitt (BL), linfoma de Hodgkin (LH), linfoma difuso de grandes células B e doenças linfoproliferativas em hospedeiros imunocomprometidos ^9,10. O EBV também demonstrou estar associado ao desenvolvimento de doenças autoimunes sistêmicas. Alguns exemplos dessas doenças autoimunes são artrite reumatoide (AR), polimiosite-dermatomiosite (PM-DM), lúpus eritematoso sistêmico (LES), doença mista do tecido conjuntivo (MCTD) e síndrome de Sjögren (SS)¹¹. O EBV também está associado ao desenvolvimento de doença inflamatória intestinal (DII)¹².

Muitas dessas doenças podem ser estudadas ou modeladas usando cultura de células, camundongos ou outros organismos infectados com EBV. É por isso que as partículas de EBV são necessárias para infectar células ou organismos, seja em modelos in vitro ou in vivo ^13,14,15,16, daí a necessidade de desenvolver uma técnica que permita o isolamento de partículas virais a um baixo custo. O protocolo descrito aqui fornece diretrizes para uma maneira fácil de isolar de forma confiável as partículas de EBV de uma linhagem celular relativamente acessível e quantificar as partículas usando PCR em tempo real, que é econômica e prontamente disponível para a maioria dos laboratórios. Isso ocorre em comparação com vários outros métodos que têm sido descritos para isolar o EBV de diferentes linhagens celulares^17,18,19,20.

P3HR-1 é uma linhagem celular BL que cresce em suspensão e é infectada de forma latente com uma cepa de EBV tipo 2. Esta linhagem celular é produtora de EBV e pode ser induzida a produzir partículas virais. O objetivo deste manuscrito é apresentar um método que permita o isolamento de partículas de EBV da linhagem celular P3HR-1, seguido da quantificação do estoque viral que poderia ser posteriormente utilizado para modelos experimentais de EBV in vitro e in vivo .

Protocol

NOTA: O EBV deve ser considerado um material potencialmente bioperigoso e, portanto, deve ser manuseado sob contenção de Nível de Biossegurança 2 ou superior. Um jaleco, bem como luvas devem ser usados. Se houver potencial para exposição a salpicos, a proteção ocular também deve ser considerada. O procedimento a seguir deve ser conduzido em um Gabinete de Segurança Biológica. 1. Contando as células P3HR1 Células de centrifugação e ressuspensão…

Representative Results

O objetivo deste procedimento é isolar partículas de EBV em uma suspensão com título viral conhecido, que poderia posteriormente ser usada para modelar a infecção por EBV. Assim, é de extrema importância utilizar concentrações ótimas dos diferentes reagentes para obter o maior rendimento de EBV fora do procedimento. Um ensaio de otimização foi realizado para determinar as concentrações de PMA e DMSO que produziriam o maior número de partículas de EBV (Figu…

Discussion

A produção de partículas de EBV é necessária para a compreensão da biologia deste vírus, bem como suas doenças associadas. Aqui descrevemos a produção dessas partículas a partir da linhagem celular P3HR-1. Esta linhagem celular não é a única linha produtora de EBV; de fato, as partículas de EBV também foram isoladas das células B95-8^21,22, bem como da linhagem celular Raji^18,19. O ciclo …

Materials

0.2 mL thin-walled PCR tubes	Thermo Scientific	AB0620	Should be autoclaved before use
0.2-10 µL Microvolume Filter Tips	Corning	4807	Should be autoclaved before use
0.5-10 µL Pipette	BrandTech	704770
10 mL Disposable Serological Pipette	Corning	4488
1000 µL Filtered Pipette Tips	QSP	TF-112-1000-Q
100-1000 µL Pipette	Eppendorf	3123000063
100×20 mm Cuture Plates	Sarstedt	83.1802
10-100 µL Pipette	BrandTech	704774
15 mL Conical Tubes	Corning	430791
200 µL Filtered Pipette Tips	QSP	TF-108-200-Q
20-200 µL Pipette	Eppendorf	3123000055
50 mL Conical Tubes	Corning	430828
CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler	Bio-Rad	184-1000
DMSO	Amresco	0231
DNase/RNase Free Water	Zymo Research	W1001-1
EBER Primers	Macrogen	N/A	Custom Made Primers
EBV DNA Control (Standards)	Vircell	MBC065
Ethanol (Laboratory Reagent Grade)	Fischer Chemical	E/0600DF/17
Fetal Bovine Serum	Sigma	F9665
Fresco 21 MicroCentrifuge	Thermo Scientific	10651805
Glycogen Solution	Qiagen	158930
Hemocytometer	BOECO	BOE 01
Inverted Light Microscope	Zeiss	Axiovert 25
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121
Microcentrifuge Tube	Costar (Corning)	3621	Should be autoclaved before use
P3HR-1 Cell Line	ATCC	HTB-62
Penicillin-Streptomycin Solution	Biowest	L0022
Phenol	VWR	20599.297
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139
Pipette Filler	Thermo Scientific	9501
Precision Wipes	Kimtech	7552
RPMI-1640 Culture Medium	Sigma	R7388
SL 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004030
Sodium Acetate	Riedel-de Haën (Honeywell)	25022
Spectrophotomer	DeNovix	DS-11
Tris-HCl	Sigma	T-3253
Trypan Blue Solution	Sigma	T8154
Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Scientific	4121