Clasificación negativa de neuronas de núcleos activados por fluorescencia combinada con secuenciación de ARN de núcleos únicos para estudiar el nicho neurogénico del hipocampo

Summary

Aquí se presenta un método para secuenciar núcleos individuales aislados del giro dentado de ratón que excluye la mayoría de las neuronas a través de la clasificación de núcleos activados por fluorescencia (FAN). Este enfoque genera perfiles de expresión de alta calidad y facilita el estudio de la mayoría de los otros tipos de células representadas en el nicho, incluidas las poblaciones escasas, como las células madre neurales.

Abstract

La neurogénesis del hipocampo adulto (AHN), que consiste en un mantenimiento de por vida de células madre neurales proliferativas y quiescentes (NSC) dentro de la zona subgranular (SGZ) del giro dentado (DG) y su diferenciación de neuronas recién nacidas en células granulares en la capa de células granulares, está bien validada en numerosos estudios. El uso de animales modificados genéticamente, particularmente roedores, es una herramienta valiosa para investigar las vías de señalización que regulan la AHN y para estudiar el papel de cada tipo de célula que compone el nicho neurogénico del hipocampo. Para abordar esto último, los métodos que combinan el aislamiento de núcleos únicos con la secuenciación de próxima generación han tenido un impacto significativo en el campo de la AHN para identificar firmas genéticas para cada población celular. Sin embargo, es necesario un mayor refinamiento de estas técnicas para perfilar fenotípicamente las poblaciones celulares más raras dentro de la DG. Aquí, presentamos un método que utiliza Fluorescence Activated Nuclei Sorting (FANS) para excluir la mayoría de las poblaciones neuronales de una suspensión de un solo núcleo aislado de DG recién diseccionado, seleccionando núcleos no teñidos para el antígeno NeuN, con el fin de realizar la secuenciación de ARN de núcleos únicos (snRNA-seq). Este método es un trampolín potencial para investigar más a fondo la regulación intercelular de la AHN y descubrir nuevos marcadores celulares y mecanismos en todas las especies.

Introduction

La generación continua de neuronas del hipocampo en la edad adulta, también conocida como neurogénesis del hipocampo adulto (AHN), se asocia con funciones cognitivas como el aprendizaje, la adquisición/eliminación de la memoria y la separación de patrones y parece ser un mecanismo importante de resiliencia en el envejecimiento y las enfermedades neurodegenerativas para prevenir déficits cognitivos ^1,2,3 . Los roedores han sido el modelo de elección para estudiar la AHN utilizando varios métodos, incluida la inmunocitoquímica y los métodos de secuenciación de próxima generación (NGS). La traducción de estos resultados a otras especies sigue siendo controvertida. De hecho, la AHN se ha observado en la mayoría de las especies, pero la medida en que persiste durante toda la vida, particularmente en humanos 4,5,6,7,8^, se debate regularmente.

Hasta la fecha, se ha confirmado que varias vías de señalización intrínsecas y extrínsecas modulan AHN¹. Sin embargo, el impacto de la comunicación intercelular en la NHA apenas está emergiendo⁹. Esto podría atribuirse en primer lugar a la especificidad insuficiente de los marcadores celulares actualmente conocidos para realizar análisis in vivo con animales modificados genéticamente. De hecho, muchos estudios se han basado en marcadores como la doble cortina o la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) que se expresan en múltiples tipos de células¹. En segundo lugar, la complejidad y el alto grado de diversidad celular en el nicho del hipocampo adulto¹⁰ plantea desafíos técnicos para perfilar cada tipo de célula. Este es particularmente el caso del análisis bioinformático con marcadores celulares superpuestos utilizados en tuberías analíticas para diferentes poblaciones, como NSC o células gliales, lo que resulta en conclusiones controvertidas al evaluar AHN ^7,11. En tercer lugar, el gran número de neuronas socava la investigación de poblaciones celulares menos abundantes, como astrocitos, oligodendrocitos o células ependimarias, a pesar de que su papel en la regulación del ajuste fino de AHN se está volviendo^{prominente 9}. Juntas, estas limitaciones afectan la capacidad de traducir los resultados de los roedores a otras especies. Esto se ve particularmente amplificado por la dificultad para recapitular in vitro un tejido complejo, como el nicho neurogénico del hipocampo, y por los muchos obstáculos para acceder a tejidos de alta calidad, junto con la falta de protocolos estandarizados para el procesamiento de tejidos en estudios con tejidos humanos^12,13. Por lo tanto, es fundamental desarrollar nuevos enfoques para perfilar las poblaciones celulares e identificar nuevos marcadores celulares dentro del giro dentado (DG) que, en última instancia, conduzcan a una mejor comprensión de las diferentes contribuciones de cada tipo de célula a la regulación de AHN.

Para lograr esto, el aislamiento de células individuales (sc) y núcleos únicos (sn) combinado con la secuenciación de ARN se ha convertido en un instrumento para investigar tejidos complejos como el DG¹⁴. Como tal, las estrategias de enriquecimiento celular para aislar células individuales del nicho del hipocampo adulto de ratón se han realizado principalmente para examinar NSCs^15,16. Una estrategia interesante para enriquecer las células no neuronales de la DG se aplicó mediante la secuenciación de células simples dobles negativas GluR1/Cd24 que resultó en la secuenciación de 1.408 células sin grupos distintos entre astrocitos y NSC después del análisis bioinformático¹⁷. Esto podría deberse a la dura digestión enzimática requerida para la preparación de una sola célula que daña la integridad celular y el ARN. Para evitar este problema técnico, se han desarrollado varios métodos que utilizan el aislamiento de núcleos únicos y son particularmente adecuados para tejidos intrincados^11,18. Sin embargo, el predominio de neuronas dentro de la DG o más ampliamente dentro del sistema hipocampo-entorrinal genera un sesgo de muestreo para estudiar la totalidad de las poblaciones celulares presentes dentro de estas áreas cerebrales. Además, el número limitado de células a cargar para la preparación de bibliotecas de células individuales acentúa la presencia de la población celular principal en las tuberías analíticas de núcleos únicos secuenciados. De hecho, los grandes grupos neuronales a menudo son anotados y analizados, mientras que otras poblaciones celulares están subrepresentadas o se pierden ^5,11.

En un intento por superar estos sesgos y poder perfilar tipos celulares distintos de las neuronas presentes en el DG del ratón, se ideó un método en este estudio utilizando el principio de clasificación de núcleos activados por fluorescencia (FANS)¹⁸ que excluye la mayoría de las poblaciones neuronales por selección negativa de núcleos únicos teñidos con antígeno nuclear neuronal (NeuN, también conocido como Rbfox3). Esta elección del antígeno fue guiada por la literatura que describe NeuN como un marcador neuronal confiable¹⁹ y por la necesidad de utilizar una proteína nuclear para este enfoque. Las células clasificadas por FACS NeuN negativo se prepararon para la secuenciación de ARN en una plataforma genómica 10x. Los resultados demuestran que la exclusión de las células que expresan NeuN permite un perfil transcriptómico de alta calidad específico para el tipo celular de las poblaciones de células gliales y raras.

Protocol

El cuidado de los animales y los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las directrices del Instituto Francis Crick, así como con las directrices y leyes del Ministerio del Interior del Reino Unido.

Figura 1: Preparación de una suspensión de un solo núcleo a partir de la DG diseccionada de ratones adultos para snRNA-seq de poblaciones no neuronales. Diagrama de flujo que describe los pasos principales del protocolo que incluyen la disección de DG de ratón, la preparación de una suspensión de núcleos únicos, inmunotinción de NeuN y clasificación negativa de NeuN-FANS antes de proceder con snRNA-seq. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Disección del DG (Duración: 15 min)

1. Preparar los medios de aislamiento de núcleos 1 y 2 (NIM1 y NIM2), el tampón de homogeneización (HB) y los medios de lavado (WM) (Tabla suplementaria 1). Coloque todos los tampones, medios, reactivos y herramientas en hielo hasta que sea necesario. Coloque el homogeneizador Dounce (consulte la Tabla de materiales) en hielo durante la preparación (mínimo 1 h antes de la etapa de homogeneización).
   NOTA: NIM1 se puede preparar y almacenar a 4 °C durante un máximo de 6 meses. NIM2, HB y WM deben estar recién preparados.
   PRECAUCIÓN: Manipule DTT, el inhibidor de la proteasa y Triton X-100 con cuidado. Estos compuestos son irritantes para la piel y los ojos, extremadamente tóxicos y peligrosos para el medio ambiente acuático. Mientras usa estos productos químicos, use guantes protectores, ropa, protección para los ojos y la cara, lávese bien las manos después de manipularlos y evite la liberación al medio ambiente.
2. Eutanasia de un ratón macho C57Bl/6J de 22 meses de edad por luxación cervical siguiendo el procedimiento²⁰ del Anexo 1 del Ministerio del Interior.
   NOTA: Consulte la discusión para conocer la justificación del uso de ratones de 22 meses de edad en este estudio. Sin embargo, este protocolo se puede realizar a cualquier edad a lo largo de la vida.
3. Diseccionar el cerebro de un ratón sacrificado y transferirlo a una placa de Petri de 10 cm llena de 1x PBS helado (Figura 1). Coloque la placa de Petri en hielo. Retire el cerebelo con un bisturí y corte el cerebro por la mitad entre ambos hemisferios (a lo largo del eje sagital).
4. Rellene una nueva placa de Petri de 10 cm con PBS helado y colóquela sobre hielo. Transfiera la mitad del cerebro a la nueva placa de Petri. Usando binoculares, disecciona el DG y repite este paso para obtener el segundo DG de la segunda mitad del cerebro.
   NOTA: Estos pasos (pasos 1.2-1.4) fueron adaptados de un procedimiento descrito anteriormente²¹. Es importante proceder lo más rápido posible en esta etapa para preservar la integridad de las células.
5. Transfiera los dos DG al homogeneizador Dounce preenfriado y agregue 1 ml de HB frío.

2. Disociación tisular, aislamiento de núcleos únicos e inmunotinción anti-NeuN (Duración: 2 h)

1. Homogeneice el tejido con 10 golpes de la mano suelta "A", seguidas de 15 golpes de la mano de mortero "B" apretada.
   NOTA: La homogeneización de rebote debe realizarse con el mortero sobre hielo con movimientos suaves para reducir el calor causado por la fricción y la formación de espuma. Todos los tampones y equipos deben enfriarse previamente y mantenerse en hielo durante el procedimiento.
2. Transfiera el homogeneizado a un tubo preenfriado de 15 ml; enjuague el homogeneizador Dounce con 1 ml de HB frío y combine hasta el mismo tubo. Añadir 3 ml de HB al tubo de 15 ml e incubar 5 min en hielo. Mezclar 2x invirtiendo el tubo suavemente.
3. Prehumedezca una tapa filtradora de 70 μm con 0,5 ml de HB sobre un tubo de ensayo de 50 ml. Colar la suspensión de núcleos del paso 2.2 volcando suavemente el tubo de 15 ml en el filtro celular. Lave el filtro celular con 0,5 ml de HB.
4. Retirar el filtro celular y centrifugar el tubo de ensayo a 500 x g durante 5 min a 4 °C, utilizando una centrífuga de cucharón giratorio. Deseche el sobrenadante.
   NOTA: Colar el homogeneizado ayudará a reducir los desechos, lo cual es crítico para la citometría de flujo y los pasos posteriores de snRNA-seq.
5. Resuspender el pellet suavemente en 4 ml de HB utilizando una pipeta P1000. Incubar en hielo durante 5 min. Girar a 500 x g durante 10 min a 4 °C. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 3 mL de WM.
6. Humedezca previamente una tapa de filtro de 35 μm sobre un tubo de ensayo de 15 ml con 0,5 ml de WM. Cuele la suspensión de núcleos desde el paso 2.5 a través del filtro celular, pipeteando suavemente 0,5 ml a la vez con una pipeta P1000.
7. Lave el tapón del colador con 0,5 ml de WM y coloque el tubo sobre hielo. Transfiera el filtrado a un nuevo tubo de 15 ml y centrifugar durante 5 min y 4 °C a 500 x g. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 3 mL de WM.
8. Girar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 mL de WM con el anti-NeuN, anticuerpo conjugado Alexa Fluor 488 (anti-NeuN-AF488, 1:32.000) y 1 μg/mL DAPI. Incubar durante 45 minutos sobre hielo en la oscuridad.
   NOTA: Para optimizar la inmunotinción de núcleos aislados, se recomienda valorar el anticuerpo para determinar la dilución óptima para el análisis y clasificación por citometría de flujo. Luego, ejecute controles adecuados para confirmar que las condiciones de tinción son óptimas. Por ejemplo, con el anticuerpo anti-NeuN-AF488 conjugado, se realizó un control negativo (es decir, sin adición del anticuerpo, Figura suplementaria 1A) y un control positivo (es decir, tinción con el anticuerpo, Figura suplementaria 1B) para evaluar la segregación de poblaciones no teñidas y teñidas. Al comenzar a trabajar con un anticuerpo conjugado con AF488, se recomienda ejecutar un control de isotipo conjugado con AF488 para evaluar la especificidad. Si se utiliza un anticuerpo no conjugado, podría ser necesario un control adicional, como agregar un anticuerpo secundario solo a una preparación de núcleos, para evaluar la unión inespecífica del anticuerpo secundario.

3. Clasificación de núcleos activados por fluorescencia (FANS) para excluir poblaciones neuronales (Duración: 45 min)

1. Transfiera la suspensión de núcleos inmunoteñidos a un tubo de ensayo de 5 ml y manténgala en hielo hasta el inicio del procedimiento de citometría de flujo.
   NOTA: Si se trabaja con trozos más grandes de tejido que dos DG de ratón, podría ser necesaria una dilución adicional con tampón WM para evitar obstruir el FACS si la densidad de núcleos en la solución se vuelve alta.
2. Realice un vórtice de las muestras durante 3 s a baja velocidad antes de colocar los tubos en el instrumento FACS (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: (Configuración FACS) Las máquinas clasificadoras deben alinearse al inicio del procedimiento con partículas de calibración siguiendo las recomendaciones del fabricante. El retardo de caída se calibró con perlas o microesferas (véase el cuadro de materiales) de acuerdo con el modelo FACS. Las muestras se clasificaron a 4 °C en modo de pureza. Para reducir el volumen de recolección, los núcleos se clasificaron a través de una boquilla de 70 μm a la presión recomendada para el citómetro de flujo. Los núcleos se clasificaron en tubos de unión baja de 1,5 ml (ver Tabla de materiales) que contenían 50 μL de WM. Todos los tubos de recolección se recubrieron con PBS + 5% BSA a 4 °C durante la noche para reducir el riesgo de que los núcleos se adhieran a las paredes del tubo.
3. Para adquirir los datos de una muestra de la suspensión de núcleos teñidos, establezca las puertas en altura DAPI y el área DAPI para excluir los restos celulares y los núcleos agregados (Figura 2A). Además, separe los núcleos individuales de cualquier agregado teñido de DAPI restante o restos celulares configurando las puertas en el área de dispersión lateral (SSC) del registro y el área de dispersión directa del registro (FCS) (Figura 2B).
4. Establezca las puertas para el anti-NeuN-AF488 y el área FSC, para aislar a la población NeuN-AF488 negativa, como se muestra en la Figura 2C.
5. Después del análisis, utilizando la estrategia de compuerta descrita anteriormente, clasifique la población NeuN-AF488 negativa en un tubo de recolección de 1,5 ml lleno de 50 μL de WM.
   NOTA: Siguiendo la estrategia de compuerta descrita anteriormente y el procedimiento de disección para aislar el DG del cerebro de un ratón adulto, se espera que la población negativa a NeuN-AF488 represente ~ 14% de los núcleos individuales.

Figura 2: Aislamiento y perfil transcriptómico de poblaciones celulares no neuronales de la DG. (A-C) Estrategia de activación para aislar núcleos únicos negativos de NeuN-AF488 y excluir restos celulares. (A) Diagrama de puntos FANS de una muestra representativa de núcleos aislados, que representa la configuración de la puerta para la selección de núcleos DAPI+ y la exclusión de restos y agregados celulares. (B) Selección adicional de núcleos únicos relevantes utilizando el área FSC y el área SSC. (C) Las puertas para NeuN-AF488 para excluir la población positiva y clasificar para los núcleos únicos negativos. (D) Micrografía de una buena suspensión de un solo núcleo con una cantidad mínima de desechos y una mayor proporción de núcleos de buena calidad (forma redonda, flecha negra) en comparación con núcleos de mala calidad (flecha blanca). Barras de escala = 50 μm, 10 μm (recuadro). (E,F) Análisis de los datos de snRNA-seq y perfilado de las distintas poblaciones celulares aisladas del DG de ratones machos C57BL/6J de 22 meses de edad. Gráficos de aproximación y proyección uniforme de variedades para la reducción de dimensiones (UMAP) de perfiles de núcleos individuales de las células (E) no clasificadas por FACS y (F) células clasificadas por FACS negativas para NeuN, coloreadas por tipo de célula. (G) Gráficos circulares que comparan las frecuencias de los tipos de células identificados en ambas muestras. (H) Métricas respectivas para las muestras secuenciadas: número de núcleos, número medio de genes y transcripciones por núcleo. (I) Gráficos de violín que muestren la distribución del número de genes y transcripciones detectadas para cada tipo de célula en ambas muestras. Astr. = astrocitos, Olig. = oligodendrocitos, Vasc. = células vasculares, CCR = células de Cajal-Retzius, Neur. = neuronas, Imm. = células inmunes, OPC = células precursoras de oligodendrocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Preparación de la suspensión de núcleos únicos para realizar la secuenciación de ARN de un solo núcleo (Duración: 30 min)

1. Después de clasificar, añadir 1 ml de PBS que contenga 1% de BSA al tubo de recogida para recoger gotas en la pared del tubo y girar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Desechar el sobrenadante, dejando 50 μL.
   NOTA: Manipule los núcleos centrífugos con cuidado, ya que puede ser difícil observar cualquier pellet en el fondo del tubo. El uso de una centrífuga de cubo oscilante ayudará a desechar el sobrenadante sin interrumpir el pellet.
2. Pipeta suavemente para resuspender núcleos centrífugos. Añadir 5 μL de la suspensión de núcleos a 5 μL de azul de tripano en un microtubo de 0,5 ml.
   PRECAUCIÓN: Manipule el azul de tripano con cuidado, ya que es peligroso para la salud, puede causar cáncer y se sospecha que daña la fertilidad o el feto. Use guantes protectores, ropa y protección para los ojos y la cara. No manipule hasta que se hayan leído y entendido todas las precauciones de seguridad.
3. Mida la concentración y evalúe la viabilidad de la suspensión de una sola célula utilizando un hemocitómetro o un contador celular automatizado (consulte la Tabla de materiales). Realice la preparación de la biblioteca y la secuenciación de los núcleos como se detalla en el paso 5.
   NOTA: Las muestras que se consideraron de buena calidad para la secuenciación mostraron forma de núcleos redondos y regulares bajo el microscopio sin restos celulares (Figura 2D). La presencia de un halo alrededor de la membrana nuclear o la agregación de múltiples núcleos juntos son signos de núcleos dañados y tales suspensiones celulares no deben considerarse para snRNA-seq (Figura 2D). La concentración medida de núcleos estaba dentro del rango de 300-700 núcleos/μL.

5. Preparación y secuenciación de la biblioteca

NOTA: La descripción de los siguientes pasos se basa en la plataforma de secuenciación interna utilizada en este estudio (consulte la Tabla de materiales). Por lo tanto, algunas configuraciones pueden diferir cuando se usa una plataforma diferente. Aquí, solo se describen los pasos clave y cada parámetro debe determinarse siguiendo las instrucciones y los protocolos del fabricante elegido, aunque con optimización antes del primer uso. Es fundamental garantizar que la preparación de las bibliotecas se realice lo más rápido posible después de concentrar las suspensiones de núcleos clasificados para evitar la degradación del ARN y garantizar una calidad óptima de la secuenciación.

1. Cargue entre 7.000 y 10.000 núcleos en un chip de célula única de microfluídica.
2. Dividir núcleos cargados en gotas de escala de nanolitros utilizando el controlador proporcionado y los reactivos del proveedor elegido. Lise los núcleos dentro de cada gota y transcriba el ARN inverso.
   NOTA: Dentro de una gota, todo el ADNc resultante compartía el mismo código de barras celular.
3. Prepare bibliotecas para snRNA-seq siguiendo las directrices del proveedor elegido y asegurando la compatibilidad con la plataforma de secuenciación. Verificar la calidad y concentración de las bibliotecas finales mediante electroforesis, fluorometría o métodos basados en qPCR y, si corresponde, agruparlas equimolarmente antes de la secuenciación.
4. Desnaturalizar agrupó 3 bibliotecas de expresión génica y diluyó según la recomendación del fabricante.
5. Realice secuenciación de indexación emparejada, simple o doble en una plataforma de secuenciación de próxima generación con una profundidad de secuenciación de 50.000 pares de lectura por celda.

Results

El protocolo presentado aquí describe un método para preparar una suspensión de núcleos únicos no neuronales aislados del DG para realizar snRNA-seq. Con o sin FANS, la agrupación bioinformática reveló grupos bien separados de núcleos correspondientes a tipos celulares conocidos dentro de la DG (Figura 2E, F). Dentro de la muestra no clasificada por FACS, la mayoría de los núcleos de alta calidad que se secuenciaron comprendían tres grupos de neuronas (84,9% del total de núcleos para esta muestra, Figura 2E, G, H). Tales resultados son esperados, considerando que las poblaciones celulares más representadas en la DG son las neuronas granulosas, otras neuronas excitadoras (neuronas excitatorias marcadas) y las neuronas inhibitorias¹⁰. Los grupos no neuronales identificados estaban formados principalmente por tipos de células gliales (11,1%), incluidos astrocitos, oligodendrocitos y células precursoras de oligodendrocitos (OPC), células inmunes (3,3%) y células de Cajal-Retzius (0,6%). Cuando se realizan FANS para excluir poblaciones NeuN positivas (muestra clasificada por FACS negativo para NeuN; Figura 2F, G, H), los grupos de células gliales se volvieron predominantes (81,3%). El aislamiento de un mayor número de núcleos gliales permite una mejor segmentación de diferentes poblaciones que se agruparían sin FANS. De hecho, al reagrupar y analizar genes específicos expresados en NSC o en astrocitos, cuatro subgrupos se separaron (Figura suplementaria 2A, B). Al observar marcadores celulares más específicos y evaluar los niveles de expresión génica en los tipos de células, se detectó un pequeño grupo de NSC que se segregaban por separado de las principales poblaciones astrocíticas con mayor expresión de Hopx y Notch2 y casi ninguna expresión de Aldh1a1 o Aqp4 (Figura suplementaria 2C). Sin embargo, debido a la superposición en la expresión génica entre los astrocitos y las NSC, se requerirían más análisis para perfilar e identificar específicamente diferentes subtipos de células. Además, la muestra FANS NeuN-negativo tenía grupos adicionales etiquetados como células vasculares (2,3%) que abarcan células endoteliales, pericitos y células leptomeníngeas vasculares cuando se hace referencia cruzada para la expresión de marcadores específicos de células (datos no mostrados).

Siguiendo la guía para el protocolo elegido para generar bibliotecas para secuenciación, se obtuvieron perfiles de expresión de alta calidad con o sin FANS. Para las muestras secuenciadas a 50.000 lecturas/núcleo, se detectaron 2.510 genes en promedio por núcleo para la muestra no clasificada por FACS (5.578 transcripciones, Figura 2H) y 1.665,5 genes (3.508 transcripciones) para la muestra FANS NeuN-negativo, después de filtrar núcleos de baja calidad (Figura 2H,I). Estas métricas confirman que este protocolo genera un perfil transcriptómico de alta calidad de núcleos individuales comparable a estudios que utilizan diferentes enfoques^22,23 y que el proceso de clasificación de FACS no daña los núcleos para snRNA-seq posterior. En particular, la diferencia en el número de genes y transcripciones por núcleo entre las dos muestras no se debe a una menor calidad de los datos, sino a la alta proporción de neuronas en la muestra no clasificada por FACS (84,9% en comparación con el 1,7% en la muestra FANS negativa para NeuN), que tienen una mayor actividad transcripcional (2.660 genes/núcleo y 6.170 transcripciones/núcleo en la muestra no clasificada por FACS) que la actividad transcripcional media de todos los tipos de células no neuronales (1.090 genes/núcleo y 1.785 transcripciones/núcleo, Figura 2I).

En conjunto, estos resultados representativos muestran que la selección de núcleos neutros negativos utilizando FANS es una herramienta poderosa para aislar tipos de células de baja abundancia de tejido cerebral recién diseccionado y realizar perfiles transcriptómicos de núcleos únicos de alta calidad de estas distintas poblaciones celulares a través de métodos snRNA-seq.

Figura complementaria 1: Validación de la inmunotinción para FANS. La suspensión de núcleos se incubó (A) sin el anticuerpo anti-NeuN-AF 488 como control negativo o (B) con el anticuerpo y se pasó por el clasificador FACS para validar las condiciones de inmunotinción. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Análisis de expresión génica y reagrupamiento del grupo de astrocitos. (A) Gráfico de aproximación y proyección uniforme de variedades para la reducción de dimensiones (UMAP) que muestra la agrupación de 4968 núcleos basada en perfiles de expresión de todo el genoma de la Figura 2F. Las llamadas de tipo celular se realizaron en función de marcadores de tipo celular. (B) Grupo de astrocitos compuesto por 2579 núcleos elegidos de (A) para un subconjunto adicional para investigar posibles subtipos celulares. Se detectaron cuatro subtipos mediante agrupamiento Seurat (0-3), mostrados por diferentes colores. (C) Niveles de expresión génica de marcadores celulares específicos en los cuatro tipos de células. Todas las parcelas se obtuvieron utilizando el paquete Seurat R²⁴. Brevemente, los recuentos de RNA-seq se normalizaron para cada célula por la expresión total y se multiplicaron por el factor de escala (10,000). Este resultado se transformó en registro. Los valores transformados se escalaron (la varianza se escaló a uno) y se centraron (la media se estableció en cero) dentro de cada celda antes de aplicar UMAP para calcular las incrustaciones, que se utilizaron como valores en los ejes x e y. Los gráficos representan la salida de una técnica de reducción dimensional en un diagrama de dispersión 2D donde cada punto representa una celda con las coordenadas x e y respectivas basadas en las incrustaciones de celdas determinadas por la técnica de reducción. Las células con firmas genéticas similares se colocan cerca unas de otras por las incrustaciones. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Análisis de la expresión génica de NeuN en el linaje neurogénico. (A) Diagrama UMAP que muestra la agrupación del linaje neurogénico a partir del conjunto de datos disponible públicamente¹⁵. Los UMAP se generaron como en la Figura suplementaria 2. (B) Niveles de expresión génica de marcadores celulares específicos en todo el linaje neurogénico que muestran astrocito (acuaporina 4 = Aqp4), NSC (proteína homeodominio solo = Hopx), NeuN / Rbfox3 (NSC y células progenitoras intermedias [IPC]) y células cíclicas (quinasa 6 dependiente de ciclina = Cdk6). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 1: Composiciones de medios y tampones utilizados en el estudio. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Para ejecutar con éxito este protocolo, la disección del DG es el primer paso crítico, que requiere cierta práctica para mantenerlo intacto y limitar la contaminación de los tejidos circundantes. Por experiencia, la separación del DG del hipocampo podría ser adquirida muy rápidamente por un investigador experto que luego podría trabajar en el refinamiento de su técnica para aumentar la rapidez de la disección y, por lo tanto, mejorar la frescura del tejido para generar datos de alta calidad. En una línea similar, la preparación y resuspensión de núcleos individuales exige consistencia entre las diferentes condiciones utilizadas en un solo experimento, pero también evitar el pipeteo excesivo que podría interrumpir la membrana nuclear liberando ARN ambientales que sesgarán los resultados de la secuenciación. Además de las recomendaciones mencionadas anteriormente para preparar núcleos de alta calidad, la concentración de la suspensión de núcleos individuales también debe considerarse antes de proceder con la secuenciación. De hecho, de acuerdo con las directrices del fabricante, una preparación con una concentración superior a 1.200 nuc/μL debe diluirse, ya que este nivel de concentración de núcleos tendrá un mayor riesgo de formar multipletes que afecten a los análisis bioinformáticos posteriores. Cabe destacar que la secuenciación de muestras con concentraciones de núcleos inferiores a 500 nuc/μL podría no valer la pena debido al costo involucrado. También se recomienda seguir los consejos de un usuario avanzado de FACS para configurar todas las compuertas y mantener la coherencia con la configuración de las muestras y las réplicas biológicas. Del mismo modo, la preparación de bibliotecas para la secuenciación de ARN implica cierta capacitación para lograr resultados de alta calidad y la mayoría de los proveedores tienen un excelente soporte para lograrlo de manera eficiente. Este método solo se probó con tejido fresco en este estudio; sin embargo, FANS también se ha realizado con tejido congelado²⁵. Por lo tanto, es razonable suponer que este protocolo podría realizarse con tejido congelado, aunque con una optimización menor.

Este protocolo ha sido desarrollado con una aplicación particular aguas abajo en mente, que es investigar poblaciones celulares distintas de las neuronas dentro del nicho neurogénico del hipocampo. De hecho, el aumento de las líneas de evidencia indican que el deterioro de la NHA en el envejecimiento podría atribuirse a las células circundantes dentro del nicho 1,2,3,9. En particular, los astrocitos y oligodendrocitos emergen como reguladores clave de AHN; sin embargo, su aislamiento de la DG junto con la secuenciación del ARN ha generado resultados mixtos, lo que hace que esta hipótesis sea difícil de evaluar con esta técnica ^1,17. Este enfoque de clasificación de núcleos NeuN negativos de FACS permitió el aislamiento de más astrocitos y oligodendrocitos en comparación con muestras que no estaban clasificadas por FACS, lo que permite un mejor análisis bioinformático. Este protocolo es aplicable a todas las edades a lo largo de la vida y los datos representativos presentados aquí con tejidos de animales viejos proporcionan una prueba de concepto de que este método es robusto para investigar el nicho neurogénico del hipocampo envejecido. Para ampliar el uso de este método y adaptarlo a diferentes cuestiones biológicas, es importante considerar que otros antígenos de membrana nuclear neuronal podrían probarse junto con una titulación exhaustiva de los anticuerpos mejor validados para estos marcadores. Por ejemplo, al estudiar el proceso de diferenciación neuronal de las NSC en la DG, algunos tipos de células, como las células tipo 2 o los neuroblastos, comienzan a expresar NeuN (Figura suplementaria 3). Por lo tanto, se necesitaría otro antígeno para investigar específicamente estos tipos de células. Por el contrario, algunas neuronas todavía se identificaron en este estudio después de la clasificación FACS negativa para NeuN, posiblemente debido a la baja o nula expresión de NeuN en estas poblaciones (por ejemplo, neuronas corticales de Cajal-Retzius¹⁹). Además, se ha informado que NeuN se expresa en subpoblaciones de oligodendrocitos²⁶, lo que podría dar resultados sesgados si estas subpoblaciones fueran de interés. Por lo tanto, la elección del antígeno al comenzar a usar FANS debe considerarse cuidadosamente para evitar la inclusión o exclusión de poblaciones celulares que impedirían una respuesta precisa a una pregunta biológica específica. De acuerdo con esto, también se recomienda que cada resultado de secuenciación se valide mediante ensayos ortogonales (por ejemplo, inmunohistoquímica o ARN-scopio) antes de validar o refutar la hipótesis probada con este protocolo. Finalmente, el paso que involucra a FANS podría desarrollarse aún más para incluir más de un anticuerpo con una estrategia de clasificación más elaborada para excluir y / o incluir las poblaciones celulares deseadas.

En última instancia, las tecnologías descritas en este protocolo podrían tener algunas limitaciones cuando se usan con otras especies. Por ejemplo, el nicho está muy bien definido en roedores con la presencia de NSC proliferativas y quiescentes o neuronas recién nacidas restringidas dentro de subregiones específicas de la DG, pero aún no está claro cómo se debe delinear el nicho neurogénico del hipocampo en otras especies. De hecho, las células proliferativas no están alineadas dentro de una zona continua de la DG en primates no humanos y humanos, sino que están dispersas alrededor de ella y también podrían estar presentes en la amígdala⁷. Por lo tanto, diseccionar y aislar áreas más amplias que el DG en otras especies podría afectar el uso de este protocolo. En particular, los pasos de disociación y trituración para la preparación del tejido deberán optimizarse mientras se trabaja con piezas más grandes de tejido^27,28. En cuanto al análisis bioinformático, mientras que los roedores alojados en endogamia tienen un genoma muy homogéneo y muy bien anotado, la variabilidad genética del genoma humano combinada con un número insuficiente de marcadores celulares para distinguir claramente diferentes poblaciones celulares (por ejemplo, NSC y astrocitos) requiere mucha normalización para el análisis que podría llevar a conclusiones diferentes cuando se identifica un pequeño grupo de células^{7, 11}. En tales situaciones, el enriquecimiento celular podría seguir siendo una opción preferida o debería usarse junto con otras estrategias para aumentar el poder analítico.

No obstante, el enfoque actual puede permitir la investigación del papel de las poblaciones celulares poco estudiadas, aunque potencialmente importantes, en la regulación de la NHA. Este podría ser particularmente el caso de las poblaciones de astrocitos, que desempeñan un papel central en la aparición y progresión de enfermedades neurodegenerativas^29,30. Este estudio demostró que los astrocitos y otras poblaciones celulares raras pueden identificarse y perfilarse simplemente excluyendo la gran mayoría de las neuronas presentes dentro de la DG. Otros estudios que utilizan diferentes enfoques no han sido capaces de lograr una recuperación similar de núcleos del mismo rango de poblaciones celulares 5,11,17. Además, los resultados de este estudio demuestran que es posible utilizar este enfoque para aislar un grupo de NSC sin un enriquecimiento específico de esta población celular¹⁵.

En conclusión, seguir y mejorar este método sería un paso adelante para abordar las cuestiones pendientes relacionadas con el papel contextual del nicho neurogénico del hipocampo para la modulación de la NHA. En particular, podría aportar nuevos conocimientos sobre los niveles de expresión génica en cerebros envejecidos y enfermos en poblaciones celulares asociadas con la regulación de AHN⁹, apoyar la identificación de una posible heterogeneidad de las NSC¹ o abordar el papel de la vasculatura en AHN. En última instancia, este método podría adaptarse para otros nichos de células madre adultas con preguntas y problemas similares.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtubo de 0,5 ml	Eppendorf	30124537
10,00µ m Flouresbrite YG Microesferas de carboxilato	Polysciences	15700-10
Tubos de centrífuga de polipropileno de 15 mL	Corning	430052
2 pares de pinzas estériles Dumont #5	Fine Science Tools	11252-30
4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Sigma Aldrich	D9564-10MG
4150 Sistema TapeStation	Agilent	N/A
5 mL tubo de ensayo de polipropileno de alta claridad con tapón a presión	Falcon	352063
5 mL tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo con filtro de celdas tapón a presión	Falcon	352235
50 mL tubos de centrífuga de polipropileno	Corning	430829
70 µ filtro de células	m Falcon	352350
8 picos SPHERO Rainbow Partículas de calibración	BD Biosciences	RCP-30-5A
Accudrop Beads	BD Biosciences	N/A
Allegra X-30R Centrífuga	Beckman Coulter	N/A Anticuerpo
anti-NeuN, clon A60, Alexa Fluor 488 conjugado	Millipore	MAB377X
BD FACSAria Citómetro de flujo	de fusión BD Biosciences	N/A
Beckman Coulter MoFlo XDP	Beckman Coulter	N/A
Chromium Controller	10x Genomics	N/A
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10x Genomics	PN-1000121; PN-1000120; PN-1000213
BSA 7.5%	Gibco	15260037
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	R0861
Juego de trituradoras de tejidos Dounce: mortero, mortero suelto (A) y mortero apretado (B)	KIMBLE	D8938-1SET
Tubos Eppendorf Protein LoBind 1.5ml	Eppendorf	30108116
Stop, 100x Inhibidor de la proteasa	ThermoFisher	78429
HiSeq 4000 Sistema de secuenciación	Illumina	N/A	Configuración de secuenciación: 28-8-0-91
KCl	Cualquier proveedor		Fabricado en laboratorio
LUNA-FX7 Contador de células automatizado	Logos Biosystems	N/A
MgCl2	Cualquier proveedor		Fabricado en laboratorio
N° 10 bisturíes desechables estériles	protegidos Swann-Morton	6601
Agua sin nucleasas	Sigma	Aldrich W4502-1L
Par de tijeras quirúrgicas estériles para estudiantes	Fine Science Tools	91401-12
PBS	Cualquier proveedor
Inhibidor de RNasa fabricado en laboratorio 40 U y micro; l-1	Ambion	AM2684
RNasin 40 U y micro; l-1	Promega	N211A
Placa de Petri estéril	Corning	430167
Sacarosa	Sigma Aldrich	59378-500G
Tampón Tris, pH 8.0	Cualquier proveedor		Fabricado en laboratorio
Triton X-100 10% (v/v)	Sigma Aldrich	T8787-250ML
Trypan blue	Invitrogen	T10282