La viabilidad de las estrategias de secuenciación del genoma completo (WGS) utilizando instrumentos de sobremesa ha simplificado la interrogación del genoma de cada microbio de relevancia para la salud pública en un entorno de laboratorio. Se describe una adaptación metodológica del flujo de trabajo para WGS bacteriano y también se presenta una tubería bioinformática para el análisis.
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Artículo de método
Caracterización de una cepa patógena de Escherichia coli derivada de granjas de Oreochromis spp.
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Resumen
Resumen
La acuicultura es uno de los sectores productores de alimentos de más rápido crecimiento en todo el mundo y el cultivo de tilapia (Oreochromis spp.) constituye la principal variedad de peces de agua dulce cultivada. Debido a que las prácticas acuícolas son susceptibles a la contaminación microbiana derivada de fuentes antropogénicas, se necesita un uso extensivo de antibióticos, lo que lleva a que los sistemas acuícolas se conviertan en una fuente importante de bacterias patógenas y resistentes a los antibióticos de relevancia clínica como Escherichia coli (E. coli). Aquí, la resistencia antimicrobiana, la virulencia y las características del mobiloma de una cepa patógena de E. coli , recuperada de Oreochromis spp. cultivada en el interior, se dilucidaron mediante secuenciación del genoma completo (WGS) y análisis in silico . Se realizaron pruebas de sensibilidad antimicrobiana (AST) y WGS. Además, el grupo filogenético, el serotipo, la tipificación de secuencias multilocus (MLST), la resistencia antimicrobiana adquirida, la virulencia, el plásmido y el contenido de profagos se determinaron utilizando diversas herramientas web disponibles. El aislado de E. coli solo exhibió susceptibilidad intermedia a la ampicilina y se caracterizó como cepa ONT: H21-B1-ST40 por tipificación basada en WGS. Aunque solo se detectó un único gen relacionado con la resistencia a los antimicrobianos [mdf(A)], se identificaron varios genes asociados a la virulencia (VAG) del patotipo enteropatógeno atípico de E. coli (aEPEC). Además, se detectó la carga de replicones plásmidos de grandes grupos plásmidos y 18 regiones asociadas a profagos. En conclusión, la caracterización WGS de un aislado aEPEC, recuperado de una piscifactoría en Sinaloa, México, permite conocer su potencial patogénico y el posible riesgo para la salud humana de consumir productos acuícolas crudos. Es necesario explotar las técnicas de secuenciación de próxima generación (NGS) para estudiar los microorganismos ambientales y adoptar un marco de salud única para aprender cómo se originan los problemas de salud.
Introducción
La acuicultura es uno de los sectores productores de alimentos de más rápido crecimiento en todo el mundo, y sus prácticas de producción están destinadas a satisfacer la creciente demanda de alimentos para el consumo humano. La producción acuícola mundial se ha triplicado de 34 millones de toneladas (Mt) en 1997 a 112 Mt en 20171. Los principales grupos de especies, que contribuyeron a casi el 75% de la producción, fueron algas, carpas, bivalvos, bagres y tilapia (Oreochromis spp.) 1. Sin embargo, la aparición de enfermedades causadas por entidades microbianas es inevitable debido a la piscicultura intensiva, lo....
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Protocolo
NOTA: La cepa ACM5 de E. coli se recuperó mediante el procesamiento y cultivo de la muestra de pescado para la determinación de coliformes fecales (FC)12. Durante el muestreo de peces, los peces no mostraron signos clínicos de enfermedad, infección bacteriana o fúngica, y prevaleció una temperatura media de 22,3 °C. Después del aislamiento, el aislado de E. coli se sometió a pruebas bioquímicas y se criopreservó en caldo de infusión cerebral cardíaca (BHI) con DMSO (8% v / v) como agente crioprotector.
1. Reactivación del cultivo de E . coli ACM5 congelado
- De la c....
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Resultados
La susceptibilidad antimicrobiana se determinó mediante el método de difusión en disco y se interpretó mediante criterios de punto de corte CLSI para 12 antibióticos que abarcan seis clases antimicrobianas distintas, es decir, aminoglucósidos, β-lactámicos, fluoroquinolonas, nitrofuranos, fenicoles y antagonistas de la vía del folato. La E. coli ACM5 mostró sensibilidad a todos los antibióticos excepto a un fármaco β-lactámico. Se probaron cuatro fármacos β-lactámicos: ampicilina, carbenicilina, cefalotina y cef.......
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Discusión
Este estudio presenta una adaptación del flujo de trabajo bacteriano de WGS utilizando un secuenciador de sobremesa y una tubería para la caracterización genómica de una variante patógena de E. coli. Dependiendo de la plataforma de secuenciación utilizada, los tiempos de respuesta (ATT) para procedimientos de laboratorio húmedos (cultivo bacteriano, extracción de ADNg, preparación de bibliotecas y secuenciación) y análisis de secuencias podrían variar, particularmente si se estudian bacterias de crecimiento lent.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACyT) por la beca de doctorado otorgada a José Antonio Magaña-Lizárraga [No. 481143].
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Accublock Mini baño seco digital | Labnet | D0100 | Baño seco para la incubación de tubos |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Perlas magnéticas en solución para la purificación de bibliotecas |
| de ADN DeNovix DS-11 | DeNovix Inc. | Espectrofotómetro UV-Vis para comprobar la calidad del ADNg extraído | |
| Tubos LoBind | Eppendorf | 0030108418 | 1,5 mL Tubos de PCR para la agrupación de bibliotecas de ADN |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 12321D | Bastidor de microtubos magnéticos utilizado durante la purificación de ADN basada en perlas magnéticas |
| Gram-negative Multibac I.D. | Investigación diagnóstica (México) | PT-35 Discos de | antibióticos estándar comerciales para pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos |
| Kit de salida media MiniSeq (300 ciclos) | Illumina | FC-420-1004 | Carro de reactivos para secuenciación de extremos emparejados (2x150) |
| MiniSeq | Illumina | SY-420-1001 | Secuenciador de sobremesa utilizado para la secuenciación de próxima generación |
| Centrífuga | MiniSpinEppendorf | 5452000816 | Centrífuga estándar para tubos |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | Reactivos para realizar librerías de ADN para secuenciación. Incluye reactivos de Caja 1 y Caja 2 para 24 muestras |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 | Conjunto de índices A, B, C, D |
| Control PhiX v3 | Illumina | FC-110-3001 | Control de biblioteca de ADN para secuenciación Baño de |
| agua de precisión | LabCare America 51221081 | Agitador de baño de agua utilizado para cultivo bacteriano | |
| Qubit 1X dsDNA HS Kit | de ensayoInvitrogen, Thermo Fisher Scientific | Q33231 | Reactivos para el ensayo de cuantificación de ADN basado en fluorescencia |
| Qubit 2.0 Fluorómetro | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Q32866 | Fluorómetro utilizado para el ensayo de fluorescencia |
| Tubos de ensayo Qubit | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Q32856 | Tubos de PCR de 0,5 ml para ensayo de cuantificación de ADN basado en fluorescencia |
| Termociclador SimpliAmp | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific | A24811 | Termociclador utilizado para la amplificación de bibliotecas |
| de ADN Espectrofotómetro Spectronic GENESYS 10 Vis | Thermo | 335900 | utilizado para suspensión bacteriana en pruebas de susceptibilidad antimicrobiana |
| ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit | Zymo Research Inc. | Kit D4300 | para extracción de ADN genómico (50 preparaciones) |
Referencias
- Naylor, R. L., et al. A 20-year retrospective review of global aquaculture. Nature. 591 (7851), 551-563 (2021).
- Quesada, S. P., Paschoal, J. A. R., Reyes, F. G. R. Considerations on the aquaculture development and on the use....
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing
Posted by JoVE Editors on 2/02/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. The Authors section was updated from:
José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental
to:
José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental
