Caracterização de uma cepa patogênica de Escherichia coli derivada de Oreochromis spp. Fazendas usando sequenciamento de genoma completo

Summary

A viabilidade de estratégias de sequenciamento do genoma completo (WGS) usando instrumentos de bancada simplificou a interrogação do genoma de cada micróbio de relevância para a saúde pública em um ambiente de laboratório. Uma adaptação metodológica do fluxo de trabalho para WGS bacteriano é descrita e um pipeline de bioinformática para análise também é apresentado.

Abstract

A aquicultura é um dos setores produtores de alimentos que mais crescem em todo o mundo e o cultivo de tilápia (Oreochromis spp.) constitui a principal variedade de peixes de água doce cultivada. Como as práticas de aquicultura são suscetíveis à contaminação microbiana derivada de fontes antropogênicas, é necessário o uso extensivo de antibióticos, levando os sistemas de aquicultura a se tornarem uma importante fonte de bactérias patogênicas e resistentes a antibióticos de relevância clínica, como a Escherichia coli (E. coli). Aqui, as características de resistência antimicrobiana, virulência e mobiloma de uma cepa patogênica de E. coli , recuperada de Oreochromis spp. cultivada no interior, foram elucidadas por meio de sequenciamento de genoma completo (WGS) e análise in silico . Foram realizados testes de suscetibilidade a antimicrobianos (AST) e WGS. Além disso, o grupo filogenético, o sorotipo, a tipagem de sequência multilocus (MLST), a resistência antimicrobiana adquirida, a virulência, o plasmídeo e o conteúdo de prófagos foram determinados usando diversas ferramentas web disponíveis. O isolado de E. coli apresentou apenas suscetibilidade intermediária à ampicilina e foi caracterizado como cepa ONT:H21-B1-ST40 por tipagem baseada em WGS. Embora apenas um único gene relacionado à resistência antimicrobiana tenha sido detectado [mdf(A)], vários genes associados à virulência (VAGs) do patótipo enteropatogênico atípico de E. coli (aEPEC) foram identificados. Além disso, a carga de replicões plasmídicos de grandes grupos plasmídicos e 18 regiões associadas a prófagos foram detectadas. Em conclusão, a caracterização do WGS de um isolado de aEPEC, recuperado de uma piscicultura em Sinaloa, México, permite insights sobre seu potencial patogênico e o possível risco para a saúde humana do consumo de produtos aquícolas crus. É necessário explorar técnicas de sequenciamento de próxima geração (NGS) para estudar microrganismos ambientais e adotar uma estrutura de saúde única para aprender como os problemas de saúde se originam.

Introduction

A aquicultura é um dos setores produtores de alimentos que mais crescem em todo o mundo, e suas práticas de produção destinam-se a satisfazer a crescente demanda de alimentos para consumo humano. A produção aquícola global triplicou de 34 milhões de toneladas (Mt) em 1997 para 112 Mt em 2017¹. Os principais grupos de espécies, contribuindo para quase 75% da produção, foram algas marinhas, carpas, bivalves, bagres e tilápias (Oreochromis spp.) ¹. No entanto, o aparecimento de doenças causadas por entidades microbianas é inevitável devido à piscicultura intensiva, levando a potenciais perdas econômicas².

O uso de antibióticos em práticas de piscicultura é bem conhecido por prevenir e tratar infecções bacterianas, principal fator limitante da produtividade ^3,4. No entanto, os antibióticos residuais se acumulam nos sedimentos e na água da aquicultura, exercendo pressão seletiva e modificando as comunidades bacterianas associadas aos peixes e residentes ^5,6,7,8. Consequentemente, o ambiente de aquicultura serve como um reservatório para genes de resistência antimicrobiana (ARGs) e o surgimento e disseminação de bactérias resistentes a antibióticos (ARB) no meio circundante⁹. Além dos patógenos bacterianos comumente observados que afetam as práticas de piscicultura, membros da família Enterobacteriaceae são frequentemente encontrados, incluindo cepas patogênicas humanas de Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp. e Salmonella spp.10. E. coli é o microrganismo mais comum isolado da farinha de peixe e da água na piscicultura 11,12,13,14,15.

E. coli é uma bactéria gram-negativa versátil que habita o trato gastrointestinal de mamíferos e aves como um membro comensal de sua microbiota intestinal. No entanto, E. coli possui uma capacidade altamente adaptativa de colonizar e persistir em diferentes nichos ambientais, incluindo solo, sedimentos, alimentos e água¹⁶. Devido ao ganho e perda de genes através do fenômeno da transferência horizontal de genes (HGT), a E. coli evoluiu rapidamente para um patógeno resistente a antibióticos bem adaptado, capaz de causar um amplo espectro de doenças em humanos e animais^17,18. Com base na origem do isolamento, as variantes patogênicas são definidas como E. coli patogênica intestinal (InPEC) ou E. coli patogênica extra-intestinal (ExPEC). Além disso, o InPEC e o ExPEC são subclassificados em patótipos bem definidos de acordo com a manifestação da doença, antecedentes genéticos, características fenotípicas e fatores de virulência (FV)^16,17,19.

A cultura tradicional e as técnicas moleculares para cepas patogênicas de E. coli têm permitido a rápida detecção e identificação de diferentes patotipos. No entanto, podem ser demorados, trabalhosos e frequentemente requerem alto treinamento técnico¹⁹. Além disso, nenhum método único pode ser usado para estudar de forma confiável todas as variantes patogênicas de E. coli devido à complexidade de seu histórico genético. Atualmente, essas desvantagens foram superadas com o advento das tecnologias de sequenciamento de alto rendimento (HTS). Abordagens de sequenciamento de genoma completo (SGB) e ferramentas de bioinformática melhoraram a exploração do DNA microbiano de forma acessível e em larga escala, facilitando a caracterização aprofundada de micróbios em uma única execução, incluindo variantes patogênicas intimamente relacionadas^20,21,22. Dependendo das questões biológicas, várias ferramentas de bioinformática, algoritmos e bancos de dados podem ser usados para realizar a análise de dados. Por exemplo, se o objetivo principal é avaliar a presença de ARGs, VFs e plasmídeos, ferramentas como ResFinder, VirulenceFinder e PlasmidFinder, juntamente com seus bancos de dados associados, podem ser um bom ponto de partida. Carriço et ^al.22 forneceram uma visão detalhada dos diferentes softwares de bioinformática e bases de dados relacionadas aplicadas para análise microbiana WGS, desde o pré-processamento de dados brutos até a inferência filogenética.

Vários estudos têm demonstrado a ampla utilidade do WGS para a interrogação do genoma em relação aos atributos de resistência antimicrobiana, potencial patogênico e rastreamento do surgimento e relações evolutivas de variantes clinicamente relevantes de E. coli provenientes de diversas origens^23,24,25,26 . O WGS permitiu a identificação de mecanismos moleculares subjacentes à resistência fenotípica aos antimicrobianos, incluindo os mecanismos de resistência raros ou complexos. Isso ocorre por meio da detecção de variantes ARG adquiridas, novas mutações em genes-alvo de drogas ou regiões promotoras^27,28. Além disso, o WGS oferece o potencial de inferir perfis de resistência antimicrobiana sem a necessidade de conhecimento prévio sobre o fenótipo de resistência de uma cepa bacteriana²⁹. Alternativamente, o WGS permitiu a caracterização dos elementos genéticos móveis (MGEs) portadores de características de resistência antimicrobiana e virulência, o que impulsionou a evolução do genoma bacteriano dos patógenos existentes. Por exemplo, a aplicação de WGS durante a investigação do surto alemão de E. coli em 2011 resultou na descoberta das características genômicas únicas de um patótipo de E. coli aparentemente novo; Curiosamente, essas cepas de surto originaram-se do grupo enteroagregativo E. coli (EAEC), que adquiriu o prófago que codifica a toxina Shiga do patótipo³⁰ entero-hemorrágico de E. coli (EHEC).

Este trabalho apresenta uma adaptação metodológica do fluxo de trabalho para SGB bacterianos utilizando um sequenciador de bancada. Além disso, um pipeline de bioinformática é fornecido usando ferramentas baseadas na web para analisar as sequências resultantes e apoiar ainda mais os pesquisadores com experiência limitada ou nenhuma em bioinformática. Os métodos descritos permitiram a elucidação das características de resistência antimicrobiana, virulência e mobiloma de uma cepa patogênica de E. coli ACM5, isolada em 2011 de Oreochromis spp. cultivada no interior em Sinaloa, México¹².

Protocol

NOTA: A cepa ACM5 de E. coli foi recuperada por meio do processamento e cultivo da amostra de peixes para determinação de coliformes fecais (CF)12. Durante a amostragem dos peixes, os peixes não apresentaram sinais clínicos de doença, infecção bacteriana ou fúngica, prevalecendo uma temperatura média de 22,3 °C. Após o isolamento, o isolado de E. coli foi submetido a testes bioquímicos e criopreservado em caldo de infusão cardíaca cerebral (BHI) com DMSO (8% v/v) co…

Representative Results

A suscetibilidade aos antimicrobianos foi determinada pelo método de difusão em disco e interpretada pelos critérios de ponto de interrupção do CLSI para 12 antibióticos abrangendo seis classes antimicrobianas distintas, ou seja, aminoglicosídeos, β-lactâmicos, fluoroquinolonas, nitrofuranos, fenicol e antagonistas da via do folato. A E. coli ACM5 apresentou sensibilidade a todos os antibióticos, exceto a um fármaco β-lactâmico. Quatro drogas β-lactâmicas foram testadas: ampicilina, carbenicilina,…

Discussion

Este estudo apresenta uma adaptação do fluxo de trabalho do WGS bacteriano utilizando um sequenciador de bancada e um pipeline para caracterização genômica de uma variante patogênica de E. coli. Dependendo da plataforma de sequenciamento utilizada, os tempos de resposta (TATs) para procedimentos laboratoriais úmidos (cultivo bacteriano, extração de gDNA, preparação de biblioteca e sequenciamento) e análise de sequência podem variar, particularmente se bactérias de crescimento lento forem estudadas….

Materials

Accublock Mini digital dry bath	Labnet	D0100	Dry bath for incubation of tubes
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	Magnetic beads in solution for DNA library purification
DeNovix DS-11	DeNovix Inc.		UV-Vis spectophotometer to check the quality of the gDNA extracted
DNA LoBind Tubes	Eppendorf	0030108418	1.5 mL PCR tubes for DNA library pooling
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	12321D	Magnetic microtube rack used during magnetic beads-based DNA purification
Gram-negative Multibac I.D.	Diagnostic reseach (Mexico)	PT-35	Commercial standard antibiotic disks for antimicrobial susceptibility testing
MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles)	Illumina	FC-420-1004	Reagent cartdrige for paired-end sequencing (2×150)
MiniSeq System Instrument	Illumina	SY-420-1001	Benchtop sequencer used for Next-generation sequencing
MiniSpin centrifuge	Eppendorf	5452000816	Standard centrifuge for tubes
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	Illumina	FC-131-1024	Reagents to perform DNA libraries for sequencing. Includes Box 1 and Box 2 reagents for 24 samples
Nextera XT Index Kit v2	Illumina	FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004	Index set A, B, C, D
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001	DNA library control for sequencing
Precision waterbath	LabCare America	51221081	Water bath shaker used for bacterial culture
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q33231	Reagents for fluorescence-based DNA quantification assay
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q32866	Fluorometer used for fluorescence assay
Qubit Assay tubes	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q32856	0.5 mL PCR tubes for fluorescence-based DNA quantification assay
SimpliAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific	A24811	Thermocycler used for DNA library amplification
Spectronic GENESYS 10 Vis	Thermo	335900	Spectophotometer used for bacterial suspension in antimicrobial susceptibility testing
ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit	Zymo Research Inc.	D4300	Kit for genomic DNA extraction (50 preps)