여기에서는 최적화된 차등 초원심분리 방법을 통해 간암 조직에서 유래한 작은 세포외 소포의 농축을 설명합니다.
조직에서 유래한 작은 세포외 소포(sEV)는 소스 세포의 기능 상태와 조직의 간질 공간의 특성을 반영할 수 있습니다. 이러한 sEV의 효율적인 농축은 생물학적 기능 연구의 중요한 전제 조건이며 임상 검출 기술 및 치료용 운반체 기술 개발의 핵심입니다. sEV는 일반적으로 심하게 오염되어 있기 때문에 조직에서 분리하기가 어렵습니다. 이 연구는 간암 조직에서 고품질 sEV를 빠르게 농축하는 방법을 제공합니다. 이 방법은 소화 효소(콜라게나제 D 및 DNase Ι)를 조직과 배양하고, 70μm 세포 여과기를 통한 여과, 차등 초원심분리, 0.22μm 멤브레인 필터를 통한 여과의 4단계 공정을 포함합니다. 차동 초원심분리 단계의 최적화와 여과 단계의 추가로 인해, 이 방법에 의해 얻어진 sEV의 순도는 고전적인 차동 초원심분리에 의해 달성된 것보다 더 높다. 조직 유래 sEV 연구를 위한 중요한 방법론과 지원 데이터를 제공합니다.
작은 세포외 소포체(sEV)는 직경이 약 30nm에서 150nm이며 다양한 세포에서 분비된다1. 그들은 지질, 단백질, DNA 및 RNA와 같은 중요한 생물학적 분자를 다양한 기관, 조직, 세포 및 세포 내 부분으로 운반하여 조직 세포와 통신하고 국소 또는 먼 미세 환경을 조절할 수 있습니다. 따라서, 그들은 또한 수신자 셀(2,3)의 동작을 변경할 수 있다. 특정 sEV의 분리 및 정제는 질병의 발달 및 경과 동안 생물학적 거동을 연구하기 위한 필수 전제 조건입니다. 금본위제로 간주되는 차등 초원심분리는 일반적으로 sEV가 일반적으로 상주하는 조직에서 분리하는 데 사용됩니다4. 조직 파편, 세포 파편, 큰 소포 및 세포 사멸체는 이 기술로 제거할 수 있으며 sEV만 남습니다.
콜라게나제 D와 DNase I은 세포나 소포의 분자적 특성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며, 두 효소의 특성은 세포외 기질에서 소포의 방출에 기여한다 5. 이 효소는 인간 전이성 흑색종 조직, 결장암 조직 및 결장 점막 조직에서 sEV를 추출하는 데 사용되었습니다 5,6,7. 그러나 이러한 방법에서 콜라게나제 D와 DNase I의 농도와 소화 시간이 다르기 때문에 일관성 없는 결론이 도출됩니다. 다른 유형의 sEV가 공침되는 것을 피하기 위해, 연구자들은 여과 및/또는 차등 원심분리를 통해 더 큰 세포밖 소포(직경 0.1 μm 또는 0.2 μm)를 제거했다8. 근원 조직에 따라, 다른 분리 및 정제 방법이 요구될 수 있다 9,10.
전통적인 차등 초원심분리 방법을 사용하여 간 조직에서 sEV를 추출하면 상등액 표면에 백질층이 생성되지만 그 특성을 결정할 방법이 없습니다. 이전 연구11에서 이 백질층은 sEV의 순도에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌습니다. 기존 방법으로 분리한 샘플의 입자 수와 단백질 농도는 현재 방법보다 높았지만 변동 계수가 컸는데, 이는 많은 오염 물질이 결과의 반복성을 저하시킬 수 있기 때문일 수 있습니다. 즉, 세제를 사용하여(즉, 1% Triton X-100에서 입자의 용해도를 검출), 이 방법으로 얻은 sEV의 순도가 더 크다는 것을 발견했습니다. 따라서 우리는 이 방법을 사용하여 단백체 연구를 위해 대장암 조직에서 파생된 sEV를 분리하고 정제합니다.
현재 간암에서 sEV에 대한 연구는 주로 혈청, 혈장 및 세포 배양의 상층액12,13,14에 초점을 맞추고 있습니다. 그러나 간암 조직에서 유래한 sEV는 간암의 생리학적 병리 및 주변 미세 환경을 보다 정확하게 반영할 수 있으며 다른 EV의 분해 및 오염을 효과적으로 방지할 수 있습니다15,16. 차등 초원심분리를 사용하여 이 방법은 수율을 높이고 고품질 sEV를 얻을 수 있어 간암에 대한 추가 연구를 위한 중요한 기반을 제공합니다. 이 방법은 간암 조직이 날카로운 분리에 의해 분리되고 콜라게나제 D와 DNase I에 의해 해리될 수 있도록 합니다. 그런 다음 세포 파편, 큰 소포 및 세포 사멸체는 여과 및 차등 초원심분리에 의해 추가로 제거됩니다. 마지막으로, sEV는 이후 연구를 위해 분리 및 정제됩니다.
이 프로토콜은 간암 조직에서 sEV를 추출하는 반복 가능한 방법을 설명합니다. 고품질 sEV는 날카로운 조직 분리, 소화 효소 처리, 차등 초원심분리, 0.22μm 필터 멤브레인 여과 및 정제를 통해 얻을 수 있습니다. 다운스트림 분석의 경우 sEV의 고순도를 보장하는 것이 매우 중요합니다. 차등 원심 분리 과정에서 상청액 표면에 백색 물질 층 (알려지지 않은 조성)이 나타납니다. 이 층은 sEV를 오염시킬 ?…
The authors have nothing to disclose.
저자들은 이 작업을 지원해 준 간난 의과대학 제1부속병원에 감사를 표한다. 이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 82260422)의 지원을 받았습니다.
0.22 µm Membrane Filter Unit | Millex | SLGPR33RB | |
1 mL Sterile syringe | Hubei Xianming Medical Instrument Company | YL01329 | |
2% Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | |
4.7 mL Centrifuge Tube | Beckman Coulter | 361621 | |
6-well Cell cuture plate | LABSELECT | 11110 | |
50 mL Beaker | Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company | CF2100800 | |
70 µm Cell strainer | Biosharp | BS-70-XBS | |
100 mm Cell culture dish | CELL TER | CS016-0128 | |
600 µL Centrifuge tube | Axygen | MCT060C | |
BCA protein quantification kit | Thermo Fisher | RJ240544 | |
Beckman Coulter Optima-Max-TL | Beckman | A95761 | |
BioRad Mini trans-blot | Bio-Rad | 1703930 | |
BioRad Mini-Protean | Bio-Rad | 1645050 | |
CD63 Antibody | Abcam | ab134045 | |
CD9 Antibody | Abcam | ab263019 | |
Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428HQ527333 | |
Cleaning Solution | NanoFCM | C1801 | |
Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
Copper net | Henan Zhongjingkeyi Technology Company | DJZCM-15-N1 | |
Dry Thermostat | Hangzhou allsheng instruments company | AS-01030-00 | |
FITC Anti Human CD9 Antibody | Elabscience | E-AB-F1086C | |
Glycine | Solarbio | G8200 | |
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody | Proteintech | SA00001-1 | |
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody | Proteintech | SA00001-2 | |
Methanol | Shanghai Zhenxing Chemical Company | ||
Nanoparticle flow cytometer | NanoFCM INC | FNAN30E20112368 | |
Phosphatase inhibitors(PhosSTOP) | Roche | 4906845001 | |
Phosphate Buffered Saline(PBS) | Servicebio | G4202 | |
Polyvinylidene Difluoride Membrane | Solarbio | ISEQ00010 | |
QC Beads | NanoFCM | QS2502 | |
RPMI-1640 basic medium | Biological Industries | C11875500BT | |
Scalpel | Guangzhou Kehua Trading Company | NN-0623-1 | |
Silica Nanospheres | NanoFCM | S16M-Exo | |
Transference Decoloring Shaker TS-8 | Kylin-Bell | E0018 | |
Transmission Electron Microscope | Thermo Scientific | Talos L120C | |
Tris | Solarbio | T8060 | |
TSG101 Antibody | Proteintech | 28283-1-AP | |
Tweezer | Guangzhou Lige Technology Company | LG01-105-4X |