Здесь мы представляем протокол сбора адгезивных клеток из многослойных колб закрытым полуавтоматическим способом с использованием системы противоточного центрифугирования. Этот протокол может быть применен для сбора как адгезивных, так и суспензионных ячеек с других платформ расширения ячеек с небольшими изменениями существующих этапов.
Мезенхимальные стволовые клетки человека (МСК) в настоящее время изучаются в качестве перспективного клеточного терапевтического метода лечения различных заболеваний, и в течение следующих нескольких лет ожидается больше одобрений рынка для клинического использования. Чтобы облегчить этот переход, решающее значение имеет устранение узких мест, связанных с масштабом, воспроизводимостью от партии к партии, стоимостью, соблюдением нормативных требований и контролем качества. Эти проблемы можно решить, закрыв процесс и внедрив автоматизированные производственные платформы. В этом исследовании мы разработали закрытый и полуавтоматизированный процесс пассажирования и сбора хМСК, полученных из желе Уортона (WJ) (WJ-hMSCs), из многослойных колб с использованием противоточного центрифугирования. WJ-hMSCs были расширены с использованием совместимой с нормативными требованиями безсывороточной среды без ксено (SFM XF), и они показали сопоставимую пролиферацию клеток (удвоение популяции) и морфологию с WJ-hMSCs, расширенными в классических средах, содержащих сыворотку. Наш закрытый полуавтоматический протокол сбора показал высокое извлечение клеток (~98%) и жизнеспособность (~99%). Клетки, промытые и сконцентрированные с помощью противоточного центрифугирования, поддерживали экспрессию поверхностных маркеров WJ-hMSC, колониеобразующие единицы (КОЕ-F), потенциал дифференцировки трилинейных и профили секреции цитокинов. Полуавтоматический протокол сбора клеток, разработанный в исследовании, может быть легко применен для мелкой и среднемасштабной обработки различных адгезивных и суспензионных ячеек путем прямого подключения к различным платформам расширения клеток для уменьшения объема, промывки и сбора урожая с низким выходным объемом.
Мезенхимальные стволовые клетки человека (МСК) являются отличным кандидатом для клинического применения, как в тканевой инженерии, так и в клеточной терапии, учитывая их терапевтический потенциал и высокий потенциал самообновления для роста in vitro, которые имеют решающее значение для получения клинически значимых доз клеток 1,2,3. По данным ClinicalTrials.gov, в настоящее время проводится более 1,000 клинических испытаний различных заболеваний4. На фоне растущего интереса к использованию hMSCs в ближайшем будущем неизбежны новые клинические испытания и одобрения рынка 5,6. Тем не менее, производство hMSC имеет много неотъемлемых проблем с точки зрения вариабельности от партии к партии, использования сырья с высоким риском, опасений по поводу загрязнения из-за многих открытых и ручных процессов, поскольку производство включает в себя несколько единичных операций, более высокие затраты на рабочую силу, стоимость масштабирования или масштабирования, а также нормативные препятствия 6,7,8,9,10, 11,12. Эти вопросы по-прежнему являются серьезным препятствием для доступа к нынешним и будущим рынкам.
Разработка закрытых, модульных, автоматизированных производственных решений и использование вспомогательных реагентов с низким уровнем риска позволят решить эти проблемы. Это также обеспечит стабильное качество продукции, снизит вероятность сбоев партии из-за человеческой ошибки, снизит затраты на рабочую силу и улучшит стандартизацию процессов и соответствие нормативным требованиям, например, с точки зрения цифрового учета партий 8,12,13,14. Чтобы иметь возможность получить клинически значимую дозировку клеток, будь то аутологичная или аллогенная доза, решающее значение имеет оптимизированное производство, которое включает в себя расширение клеток вверх по течению и последующую обработку в закрытом, автоматизированном режиме.
Для расширения hMSC в настоящее время используются два наиболее распространенных метода производства: горизонтальное масштабирование (2D-монослой) и масштабирование (система суспензии на основе 3D-микронесущих)15,16,17,18. Наиболее традиционным и широко распространенным методом расширения hMSC является 2D-монослойная культура из-за низкой стоимости производства и простоты настройки19.
Многослойные колбы, состоящие из лотков с плоской поверхностью, уложенных в культуральный сосуд, обычно используются для масштабирования производства hMSC. Эти системы обычно поставляются в емкостях для культивирования от 1 до 40 слоев20 и обрабатываются вручную внутри шкафов биобезопасности. Этапы обработки во время прохождения и сбора клеток включают ручное дозирование и декантацию расширительной среды, диссоциативного реагента и буфера для промывки путем пипетирования или физического наклона всего сосуда. Кроме того, работа с несколькими устройствами является сложной задачей и отнимает много времени из-за их огромных размеров и веса.
Впоследствии, послеуборочная обработка из многослойных колб, центрифугирование для замены среды, промывка ячеек и уменьшение объема являются важными этапами всего рабочего процесса21 производства ячеек. Обычное настольное центрифугирование представляет собой в основном открытый и ручной процесс, который включает в себя множество этапов, таких как перенос клеточной суспензии в закрытые пробирки или бутылки внутри шкафа биобезопасности, вращение клеток, ручная аспирация надосадочной жидкости, ресуспендирование клеток с буфером и повторная промывка клеток. Это значительно увеличивает как риск загрязнения из-за открытия и закрытия крышек, так и вероятность потери клеточного гранулирования во время процесса ручной аспирации/пипетирования22. В контексте работы с многослойными системами культивирования адгезивных клеток, таких как hMSCs, оператору необходимо будет пройти трудоемкий процесс многократного перемещения между центрифугой и шкафом биобезопасности и одновременного обращения с тяжелой установкой. Эти ручные действия трудоемки, представляют риск с точки зрения человеческих ошибок и загрязнения и должны выполняться в чистых помещениях класса B, что является дорогостоящим23. Кроме того, обычный процесс ручного центрифугирования не является масштабируемым и может вызвать клеточный сдвиг и напряжение; Таким образом, максимизация извлечения клеток, жизнеспособности и эффективности вымывания остаточных примесей являются другими серьезными проблемами22. Коммерческое производство клеточной терапии в масштабе cGMP требует закрытых модульных решений автоматизации для снижения риска загрязнения, обеспечения стабильного качества продукции, снижения затрат на рабочую силу и производства, а также повышения надежности процесса24,25. Многослойные колбы могут обрабатываться как закрытая система, имея стерильный фильтр 0,2 мкм в одном из портов для облегчения стерильного газообмена и второй порт, асептически соединенный через разъемы или приваренный трубкой непосредственно к автоматизированному инструменту обработки клеток для сбора клеток. Мы работали над закрытием и автоматизацией большинства этапов прохождения и сбора WJ-hMSC, оценивая инновационную закрытую противоточную центрифугу, предназначенную для производства продуктов на клеточной, генной или тканевой основе. Эта противоточная центрифуга также обладает гибкостью для выполнения различных задач обработки клеток, таких как разделение клеток на основе размера, обмена средой / буфером, концентрации и сбора для различных типов клеток 8,26,27,28. В приборе используется закрытый одноразовый комплект, который может быть стерильно соединен с помощью сварки труб или асептических соединителей для переноса мешков или может быть подключен непосредственно к любой платформе расширения по выбору.
В этом исследовании мы разработали специальный узел трубки, чтобы обеспечить закрытые стерильные соединения между одноразовым комплектом противоточного центрифугирования и многослойной колбой. Мы оптимизировали протокол для ферментативного отсоединения, промывки и сбора WJ-MSC из многослойной колбы полностью закрытым и полуавтоматическим способом за один прогон. Собранные WJ-hMSCs характеризовали по чистоте (анализ поверхностных маркеров) и активности (КОЕ-F, трехлинейная дифференцировка и профили секреции цитокинов), чтобы гарантировать, что конечный продукт соответствует критическим атрибутам качества (CQA) для высвобождения партии.
В этой работе мы показали возможность закрывать и полуавтоматизировать диссоциацию hMSC, а также промывку и сбор урожая на стенде с помощью прибора противоточного центрифугирования. Одним из важнейших шагов во всем рабочем процессе является обеспечение соединения трубок в соответствии с заданным протоколом, определенным в конструкторе протоколов противоточной центрифугирования. Настройка и эксплуатация просты, а время, необходимое для обработки около 2 л культуры из 10-слойной колбы от сборки комплекта до сбора клеток, составило около 60 минут. Одним из ограничивающих этапов этого рабочего процесса является перекачка жидкости из многослойной колбы в передаточные мешки, подключенные к прибору противоточного центрифугирования. Одноразовый комплект с высоким расходом может работать только при максимальной скорости потока 165 мл/мин, и это может быть сложно для обработки, например, 40-слойной колбы. Чтобы ускорить процесс перекачки жидкости, можно использовать внешние насосы с высокой скоростью потока для переноса трипсинизированного содержимого сначала в передаточный мешок, а затем для промывки/концентрирования и сбора клеток из передаточного мешка с использованием системы противоточного центрифугирования. Кроме того, этот протокол также может быть применен для прохода ячеек от 4-слойных до 10-слойных многослойных колб. Кроме того, система противоточного центрифугирования также может быть оптимизирована для промывки размороженных МСК и прямого сбора урожая и приготовления среды в многослойные колбы для запуска семенного конвейера. Следует отметить, что минимальное количество ячеек, необходимых для формирования кипящего слоя в камере противоточного центрифугирования, составляет примерно 30 миллионов ячеек, а максимальный рекомендуемый объем для обработки одной партии составляет 20 л.
В настоящее время крепление нестандартного узла трубки к многослойной колбе в шкафу биобезопасности и автоклавирование частей компонентов нежелательны в условиях cGMP. В качестве альтернативы сборка трубок с гамма-стерилизацией по индивидуальному заказу может быть передана на аутсорсинг поставщикам. Поставщики, поставляющие многослойные колбы, также предлагают возможность предварительной установки колб с желаемыми трубками в сборе, включая фильтр 0,2 мкм, и гамма-стерилизацию всего оборудования. Это гарантирует, что многослойные колбы и прикрепленные трубки будут действительно закрыты, а это означает, что процесс может быть завершен на стенде в чистом помещении класса C.
Этот процесс, использующий систему противоточного центрифугирования, не ограничивается культивируемыми клетками на основе адгезии в многослойном сосуде и может быть адаптирован к динамическим (биореакторы с перемешиваемым резервуаром или волновыми биореакторами) и статическим (газопроницаемым) платформам расширения клеток на основе суспензии. В частности, для hMSCs, расширенных в 3D-культурах микроносителей, протоколы могут быть оптимизированы в системе противоточного центрифугирования для сбора, промывки и составления hMSCs, диссоциированных из микроносителей.
В целом, растущий интерес к разработке трансляционной клеточной терапии с улучшенной устойчивостью и надежностью процесса привел к разработке закрытых автоматизированных платформ обработки клеток. Эти системы являются обязательными, поскольку они сокращают количество этапов обработки, предотвращают потенциальное загрязнение стерильными соединениями и снижают производственные затраты за счет сокращения трудозатрат и повышения эффективности использования пространства чистых помещений21. В соответствии с этим многие разработчики продуктов клеточной терапии, которые ищут одобрение регулирующих органов для перевода своих методов лечения, осознают важность закрытия процесса и внедрения полной автоматизации или полуавтоматизации уже на стадии разработки процесса 14,31,32.
С использованием дружественной к нормативным требованиям среды SFM XF и наряду со вспомогательными реагентами, соответствующими 21 CFR GMP Part 11 и международным рекомендациям по качеству, этот полуавтоматический процесс будет легко подходить для клинического производства. Показана воспроизводимость замкнутого процесса и поддержание качества МСК-МСК. Повышение эффективности и безопасности культивирования адгезивных клеток в многослойных колбах принесет пользу не только в области терапии МСК, но и в компаниях, занимающихся банковским обслуживанием клеточных линий и производством адгезивных вирусов.
The authors have nothing to disclose.
Авторы выражают благодарность за поддержку со стороны Фонда предварительного позиционирования промышленности (IAF-PP) (H18/01/a0/021 и H18/AH/a0/001) от A*STAR, Сингапур.
2L PVC transfer bag | TerumoBCT | BB*B200TM | |
Alcian blue solution, pH 2.5 | Merck | 101647 | |
Alizarin-Red Staining Solution | Merck | TMS-008-C | |
APC anti-human CD73 Antibody | Biolegend | 344015 | |
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | Biolegend | 400121 | |
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader | Bio-Rad | ||
Counterflow Centrifugation System | Thermo Fisher Scientific | A47679 | Gibco CTS Rotea Counterflow Centrifugation System |
Crystal Violet | Sigma-aldrich | C0775 | |
CTS (L-alanyl-L-glutamine) GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
CTS Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | A1285601 | no calcium, no magnesium |
CTS Recombinant Human Vitronectin (VTN-N) | Thermo Fisher Scientific | A27940 | |
CTS TrypLE Select Enzyme | Thermo Fisher Scientific | A1285901 | |
Custom tubing assembly | Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC) | N/A | Gamma-sterilized 3/32” ID PVC line fitted with a sterile male MPC (1/8” barb) and sealed on the other end. Autoclave a short C-Flex line fitted with a sterile Cell Factory port connector on one end and a female MPC (3/8” barb) on the other. Connect the PVC and C-Flex lines in a biosafety cabinet |
Emflon II capsule (0.2um filter) | Pall | KM5V002P2G100 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12662029 | Mesenchymal stem cell-qualified, USDA-approved regions |
FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | |
FITC anti-human CD105 Antibody | Biolegend | 323203 | |
FITC anti-human CD45 Antibody | Biolegend | 304005 | |
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody | Biolegend | 328107 | |
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | Biolegend | 400109 | |
Hi-Flow Single Use Kit | Thermo Fisher Scientific | A46575 | Gibco CTS Rotea Hi-flow single-use kit, flow rate of 30 – 165 mL/min |
Multi-layered systems | Thermo Fisher Scientific | 140360 (4-layers); 140410 (10-layers) | Nunc Standard Cell Factory Systems |
NucleoCounter NC-3000 | Chemometec | NC-3000 | |
Oil red O staining solution | Merck | 102419 | |
PDGF-BB | Thermo Fisher Scientific | PHG0045 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
PerCP anti-human CD34 Antibody | Biolegend | 343519 | |
PerCP Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody | Biolegend | 400147 | |
ProcartaPlex Multiplex Immunoassays | Thermo Fisher Scientific | Custom 19-Plex panel: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, PDGF-BB, RANTES, SDF-1α, TGFα, TNF-alpha, VEGF-A | |
Sample port | Thermo Fisher Scientific | A50111 | Gamma-sterilized leur sample port with 2 PVC lines attached |
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher Scientific | A10070-01 | |
StemPro Chondrocyte Differentiation | Thermo Fisher Scientific | A10071-01 | |
StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium) | Thermo Fisher Scientific | ME20236L1 | Contains StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x) |
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher Scientific | A10072-01 | |
T175 Nunc EasYFlask | Thermo Fisher Scientific | 159910 | |
T75 Nunc EasYFlask | Thermo Fisher Scientific | 156472 | |
TGFβ1 | Thermo Fisher Scientific | PHG9204 | |
WJ MSCs | PromoCell | (#C12971; Germany) | Human mesenchymal stem cells |
αMEM media | Thermo Fisher Scientific | 12571063 | With nucleosides |