실험적으로 진화한 개체군에서 구조적 변이의 역학을 따릅니다.
Summary
우리는 실험적 진화 동결 아카이브에 쉽게 적응할 수 있는 비단일 뉴클레오티드 다형성 대립유전자 역학을 추적하는 비용 효율적인 방법을 개발했습니다. 삼중항 PCR 기술은 실험적 진화 과정에서 삽입 대립 유전자의 상대적 빈도를 정량화하기 위해 자동화된 병렬 모세관 전기영동과 결합되었습니다.
Abstract
구조적 변이체(SV)(즉, 결실, 삽입, 복제 및 반전)는 이제 표현형 변이에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 결과적으로 질병 결정 또는 새로운 환경에 대한 적응과 같은 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다. 그러나 단일 뉴클레오티드 변이체는 SV보다 훨씬 더 많은 관심을 받는데, 이는 아마도 검출하기 쉽고 표현형 효과를 예측하기 쉽기 때문일 것입니다. 단거리 및 장판독 심층 염기서열 분석 기술의 개발로 SV 검출이 크게 향상되었지만, 풀링된 염기서열 분석(poolseq) 데이터에서 SV의 빈도를 정량화하는 것은 여전히 기술적으로 복잡하고 비용이 많이 듭니다.
여기에서 우리는 연구자들이 SV 대립 유전자 빈도의 역학을 따를 수 있도록 하는 다소 간단하고 저렴한 방법을 제시합니다. 적용의 예로서, 우리는 박테리아의 실험적 진화 집단에서 삽입 서열(IS) 삽입 빈도를 따릅니다. 이 방법은 야생형(WT)과 파생 대립유전자의 증폭에 의해 생성된 앰플리콘의 크기가 5% 이상 다르고 증폭 효율이 유사하도록 구조적 변이체 경계 주변의 프라이머 삼중체 설계를 기반으로 합니다. 그런 다음 각 앰플리콘의 양은 평행 모세관 전기영동에 의해 결정되고 보정 곡선으로 정규화됩니다. 이 방법은 다른 구조적 변이(결실, 복제 및 반전)의 빈도 정량화와 환자 내 병원체 개체군을 포함한 자연 개체군의 풀-시퀀스 접근 방식으로 쉽게 확장할 수 있습니다.
Introduction
구조적 변이체(SV)는 게놈 서열의 변경으로, 일반적으로 50bp 이상에 영향을 미칩니다. 설명된 SV의 네 가지 범주는 큰 삽입, 큰 삭제, 반전 및 중복입니다. 최근까지 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV)의 표현형 효과와 질병의 유전적 결정 요인으로서의 역할 또는 적응에 대한 기여 측면에서 구조적 변이체보다 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV)에 더 많은 관심이 기울여졌습니다. 이것은 아마도 SNV를 감지하고 표현형 효과를 예측하는 것이 더 쉽기 때문일 것입니다. 그러나 단거리 및 장판독 심층 염기서열 분석 기술은 적어도 단일 개인 또는 클론 게놈에서 SV의 검출을 크게 개선했습니다1. 이와 동시에, 이들의 표현형 효과는 더 잘 특성화되었으며, 인간 질병2,3 또는 새로운 환경4에 대한 적응의 유전적 결정인자로서의 의미에 대한 많은 예가 문서화되었습니다.
종종 이동 유전 요소(MGE) 삽입으로 인한 결실 및 삽입은 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)보다 훨씬 더 파괴적이며 프레임시프트 돌연변이 및 단백질 구조 변형으로 이어집니다. 유전자 내의 결실 및 MGE 삽입은 거의 항상 유전자 불활성화를 초래하며, 삽입 서열(IS)이 프로모터 또는 종결 서열을 함유하는 경우 비코딩 영역으로의 삽입은 인접 유전자의 억제 또는 구성적 발현을 유발할 수 있다5. 필수 유전자의 녹아웃은 박테리아 적합성에 명백한 해로운 영향을 미치지만, 비필수 유전자의 손실은 경우에 따라 유익합니다. 고유한 비용에도 불구하고 복제는 유리할 수 있으며 유전자 투여량의 변화로 이어지기 때문에 적응에 참여할 수 있습니다. 특정 단백질의 활성의 증가는 조건에 따라 유리할 수 있다6.
미생물 실험 진화 집단은 일반적으로 클론으로 시작됩니다. 이러한 유전적 다양성의 초기 부재는 시험관의 “폐쇄된 환경” 특성과 결합되어 수평적 유전자 전달 및 재조합을 통한 유전자 획득에 의한 진화 가능성을 매우 제한적으로 만듭니다. 이러한 특정 조건에서 결실, 복제 및 게놈 내 MGE 삽입의 적응에 대한 기여가 특히 중요합니다. 박테리아는 종종 기능 상실 돌연변이(주로 결실 또는 MGE 삽입으로 인한)를 통해 적응하여 안정적이고 영양이 풍부한 단일 배양 인공 환경에서 유용하지 않은 유전자에 영향을 미칩니다7. 가장 오래 지속된 대장균 진화 실험에서, IS150 삽입은 50,000세대 후에 진화된 집단에서 특히 빈번하며, IS 요소는 조상 점 돌연변이율을 유지하는 집단에서 높은 빈도에 도달하는 돌연변이의 35%를 나타낸다8.
진화 및 재서열 연구는 실험 진화와 차세대 염기서열 분석(NGS) 기술을 결합하여 박테리아가 표현형 및 게놈 수준에서 다양한 탄소 및 에너지원, 항생제 및 삼투압 스트레스와 같은 다양한 환경 조건 및 스트레스에 어떻게 적응하는지 조사합니다 9,10,11 . 이러한 연구는 전형적으로 실험적 종점에서만, 그리고 어떤 경우에는 다수의 중간 시점(12,13,14)에서 진화된 집단 또는 클론에 대한 게놈 정보를 얻는다. 이러한 데이터는 주어진 환경에 대한 적응과 관련된 유전자와 경로에 대한 통찰력을 제공하지만 연구자가 시간이 지남에 따라 새롭게 나타나고 휩쓸리는 대립 유전자의 역학을 추적하는 것을 거의 허용하지 않습니다.
이러한 역학을 따르는 한 가지 접근법은 관심 있는 분리형 대립유전자의 제한된 수를 선택하고(영향을 미치는 유전자의 기능 때문에, 독립적인 집단에서 병렬로 스윕하기 때문에 등) 앰플리콘 시퀀싱을 사용하여 대립유전자 비율을 정량화하고 동일한 시퀀싱 실행에서 많은 시점을 통합하는 것이다15. 이 방법은 실험 16개 및 자연 미생물17 개 개체군에서 작은 크기 변이체(SNP 또는1bp 인델)의 역학을 추적하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 그러나 더 큰 인델 또는 MGE 삽입의 경우 앰플리콘의 크기 차이가 PCR 효율 차이를 유도하여 판독과 대립 유전자 비율 사이의 관계를 왜곡합니다. 어떤 경우에는 두 대립 유전자 사이의 크기 차이가 앰플리콘의 고전적인 길이보다 우수합니다. 여기에서 우리는 삼중항 PCR 기술과 자동화된 병렬 모세관 전기영동을 결합하여 크기 차별을 기반으로 삽입 대립 유전자의 상대적 빈도를 정량화했습니다. 이 접근 방식을 사용하면 잘 사용되지 않는 실험 시점을 활용하여 새로운 돌연변이 대립 유전자의 역학을 결정하고 비용 효율적인 방식으로 고정 또는 손실에 대한 빈도를 따를 수 있습니다. 우리는 IS10 삽입을 통해 돌연변이된 새로운 mutS–대립유전자를 추적하기 위해 이 방법을 적용하여 돌연변이된 유전자형에 과돌연변이자 표현형을 제공했습니다.
이 방법은 크기가 ≥5% 차이가 나는 두 개의 표적 대립 유전자가 필요합니다. 첫째, 프라이머 삼중체는 공통 프라이머를 공유하는 유사한 크기의 단편을 생성하도록 설계되었습니다. 둘째, PCR 조건을 최적화하고 야생형(WT)과 돌연변이 gDNA의 혼합물을 사용하여 보정 곡선을 생성합니다. 마지막으로, 샘플은 PCR에 의해 증폭되고, 각 대립 유전자의 상대 주파수는 병렬 정량적 모세관 전기 영동에 의해 정량화됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 실험적 진화 집단에서 새로운 적응 SV 대립 유전자의 역학을 따를 수 있는 비용 효율적인 방법을 제안했습니다. 이 방법은 고전적인 PCR 기술과 자동화된 병렬 모세관 전기영동을 결합하여 두 대립 유전자의 상대적인 양을 측정할 수 있습니다. 일단 설정되면 많은 샘플에서 대립 유전자 비율을 병렬로 정량화할 수 있으며 WGS보다 훨씬 저렴합니다. 이 방법은 non-SNP 돌연변이에 대한 …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 ERC HGTCODONUSE (ERC-2015-CoG-682819)에서 S.B.에 의해 지원되었습니다. 이 작업에 사용 된 데이터는 ANR “Investissements d’ avenir”프로그램 (ANR-10-LABX-04-01)의 지원 인 LabEx CeMEB의 지원으로 Institut des Sciences de l’ Evolution de Montpellier의 GenSeq 기술 시설을 통해 (부분적으로) 생성되었습니다.
Materials
| 96 Well Skirted PCR Plate | 4titude | 4Ti – 0740 | PCR |
| Agarose molecular biology grade | Eurogentec | EP-0010-05 | Agarose gel electrophoresis |
| Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit Quick Guide for the Fragment Analyzer Systems | Agilent | PDF instruction guide | |
| Buffer TBE | Panreac appliChem | A4228,5000Pc | Agarose gel electrophoresis |
| Calibrated Disposable Inoculating Loops and Needles | LABELIANS | 8175CSR40H | Bacterial culture |
| Dneasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69506 | DNA extraction |
| Electrophoresis power supply | Amilabo | ST606T | Agarose gel electrophoresis |
| Fragment Analyzer Automated CE System | Agilent | Parallel capillary electrophoresis | |
| Fragment DNA Ladder | Agilent | DNF-396, range 1-6000bp | Parallel capillary electrophoresis |
| GENTAMICIN SULFATE SALT BIOREAGENT | Sigma-Aldrich | G1264-1G | Bacterial culture |
| High Sensitivity diluent marker | Agilent | DNF-373 | Parallel capillary electrophoresis |
| High Sensitivity NGS quantitative analysis kit | Agilent | DNF-474 | Parallel capillary electrophoresis |
| Ladder quick load 1 kb plus DNA ladder | NEB | N0469S | Agarose gel electrophoresis |
| LB Broth, VegitoneNutriSelect Plus | Millipore | 28713 | Bacterial culture |
| Master Mix PCR High Fidelity Phusion Flash | Thermo Fisher Scientific | F548L | PCR |
| Primers | Eurogentec | PCR | |
| Prosize data analysis software v.4 | Agilent | V.4 | Parallel capillary electrophoresis |
| Qubit assays | Invitrogen | MAN0010876 | DNA quantification |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | LIFE TECHNOLOGIES SAS | Q32854 | DNA quantification |
| Thermocycler | Eppendorf | Ep gradients | PCR |
| UVbox, eBOX VX5 | Vilber Lourmat | Agarose gel electrophoresis visualisation | |
| Water for injectable preparation | Aguettant | PROAMP | PCR |
Referencias
- Mahmoud, M., et al. Structural variant calling: the long and the short of it. Genome Biology. 20 (1), 246 (2019).
- Bragg, D. C., et al. Disease onset in X-linked dystonia-parkinsonism correlates with expansion of a hexameric repeat within an SVA retrotransposon in TAF1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (51), 11020-11028 (2017).
- Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. The landscape of kinase fusions in cancer. Nature Communications. 5, 4846 (2014).
- Tenaillon, O., et al. The molecular diversity of adaptive convergence. Science. 335 (6067), 457-461 (2012).
- Vandecraen, J., Chandler, M., Aertsen, A., Van Houdt, R. The impact of insertion sequences on bacterial genome plasticity and adaptability. Critical Reviews in Microbiology. 43 (6), 709-730 (2017).
- Andersson, D. I., Gene Hughes, D. amplification and adaptive evolution in bacteria. Annual Review of Genetics. 43, 167-195 (2009).
- Bailey, S. F., Bataillon, T. Can the experimental evolution programme help us elucidate the genetic basis of adaptation in nature. Molecular Ecology. 25 (1), 203-218 (2016).
- Consuegra, J., et al. Insertion-sequence-mediated mutations both promote and constrain evolvability during a long-term experiment with bacteria. Nature Communications. 12 (1), 980 (2021).
- Burch, C. L., Romanchuk, A., Kelly, M., Wu, Y., Jones, C. D. Genome-wide determination of barriers to horizontal gene transfer. bioRxiv. , (2022).
- Slomka, S., et al. Experimental evolution of Bacillus subtilis reveals the evolutionary dynamics of horizontal gene transfer and suggests adaptive and neutral effects. Genética. 216 (2), 543-558 (2020).
- Choudhury, D., Saini, S. Evolution of Escherichia coli in different carbon environments for 2,000 generations. Journal of Evolutionary Biology. 32 (12), 1331-1341 (2019).
- Tenaillon, O., et al. Tempo and mode of genome evolution in a 50,000-generation experiment. Nature. 536 (7615), 165-170 (2016).
- Behringer, M. G., et al. Escherichiacoli cultures maintain stable subpopulation structure during long-term evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4642-4650 (2018).
- Voordeckers, K., et al. Adaptation to high ethanol reveals complex evolutionary pathways. PLoS Genetics. 11 (11), 1005635 (2015).
- Levy, S. F., et al. Quantitative evolutionary dynamics using high-resolution lineage tracking. Nature. 519 (7542), 181-186 (2015).
- Bruger, E. L., Marx, C. J. A decade of genome sequencing has revolutionized studies of experimental evolution. Current Opinion in Microbiology. 45, 149-155 (2018).
- Grubaugh, N. D., et al. An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar. Genome Biology. 20 (1), 8 (2019).
- Bedhomme, S., et al. Evolutionary changes after translational challenges imposed by horizontal gene transfer. Genome Biology and Evolution. 11 (3), 814-831 (2019).
- Tenaillon, O., Toupance, B., Le Nagard, H., Taddei, F., Godelle, B. Mutators, population size, adaptive landscape and the adaptation of asexual populations of bacteria. Genética. 152 (2), 485-493 (1999).
