Este protocolo describe un experimento de migración in vitro adecuado para el análisis funcional de las moléculas involucradas en la migración in vivo de las células de la cresta neural a la matriz extracelular rica en hialuronano.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
In vitro Investigación de los efectos de la matriz extracelular rica en hialuronanos en la migración de células de cresta neural
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células de la cresta neural (NCC) son células altamente migratorias que se originan en la región dorsal del tubo neural. La emigración de NCC desde el tubo neural es un proceso esencial para la producción de NCC y su posterior migración hacia los sitios objetivo. La ruta migratoria de los NCC, incluidos los tejidos del tubo neural circundantes, involucra una matriz extracelular rica en hialuronano (HA). Para modelar la migración de NCC en estos tejidos circundantes ricos en HA desde el tubo neural, se estableció en este estudio un ensayo de migración de sustrato mixto que consiste en HA (peso molecular promedio: 1,200-1,400 kDa) y colágeno tipo I (Col1). Este ensayo de migración demuestra que las células de línea celular NCC, O9-1, son altamente migratorias en el sustrato mixto y que el recubrimiento de HA se degrada en el sitio de adherencias focales en el curso de la migración. Este modelo in vitro puede ser útil para una mayor exploración de la base mecanicista involucrada en la migración de NCC. Este protocolo también es aplicable para evaluar diferentes sustratos como andamios para estudiar la migración de NCC.
Introducción
Las células de la cresta neural (NCC) son una población celular multipotente que está presente en los embriones en desarrollo, y se originan en el borde de la placa neural durante la neurulación. Contribuyen a la formación de una variedad de tejidos, incluyendo el sistema nervioso periférico, el sistema cardiovascular, los tejidos craneofaciales y el esqueleto1. Después de la inducción y la especificación de NCC en el borde de la placa neural, los NCC emigran del neuroepitelio y migran hacia los sitios de tejido derivados de NCC1.
El hialuronano (HA) es un glicosaminoglicano no sulfatado que s....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Facultad de Odontología de la Universidad de Osaka.
1. Cultivo de células de la cresta neural craneal de ratón
NOTA: La línea celular de la cresta neural utilizada en este estudio comprende células O9-1, originalmente derivadas de Wnt1-Cre; Células que expresan R26R-GFP aisladas de embriones de ratón E8.512 (ver discusión). El método descrito aquí para el cultivo de células O9-1 sigue un protocolo previamente establecido13.
- Prepare la placa recu....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Se realizó un ensayo de migración en sustratos mixtos compuestos de Col1 y HA de alto peso molecular (peso molecular promedio: 1.200-1.400 kDa) utilizando el protocolo descrito aquí. Se encontró que las células de O9-1 en el límite de la brecha migran fácilmente a la brecha rica en HA (Figura 4). La inmunotinción para un marcador de AF, la vinculina14, confirmó que las células O9-1 formaron adherencias focales (FA) en los sitios de degradación de HA (
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Varios componentes de ECM regulan la emigración/migración de NCC. Por ejemplo, la HA regula positivamente la migración de NCC 2,15. Curiosamente, un estudio basado en modelos genéticos de ratón de Tmem2, una hialuronidasa de superficie celular, elucidó el requisito de degradación de HA en la migración de NCC9. Los colágenos también son abundantes en la ECM que rodea el tubo neural16. Se ha demostrado que la decorina.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
El autor declara que no existen intereses contrapuestos.
Agradecimientos
Expreso un gran agradecimiento a Fumitoshi Irie y Yu Yamaguchi por su aliento y amables sugerencias para establecer este método. Este trabajo fue apoyado por subvenciones para programas de investigación científica de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (#19KK0232 a T.I., #20H03896 a T.I.). El método original para el recubrimiento de HA sobre sustratos de vidrio y ensayos de degradación de HA in situ en los sustratos se describió en Yamamoto et al. (2017)8, mientras que el método para la preparación de sustratos mixtos de HA/Col1 se describió en Irie et al. (2021)7.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| plato de cultivo celular de 10 cm | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| Insertos de cultivo de 2 pocillos | ibidi | Cat. Nº 80209 | |
| Alexa 555 con etiqueta de cabra anti-ratón IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | de anticuerpo secundario anti-ratón derivado de cabra |
| Bio-Rad | Cat. No. TC20 | ||
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Medio de congelación celular |
| colágeno tipo I | Sigma | Cat. Nº 08-115 | |
| Medio Celular ES Completo | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco' s Águila Modificada Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Suero fetal bovino | Gibco | Cat. Microscopio de | |
| Keyence | Cat. No. BZ-X700 | ||
| Fluoresent etiquetado como HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Plato de fondo de vidrio | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldehído | Sigma | Cat. Nº G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | El |
| anticuerpo monoclonal anti-vinculina | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| medios de montaje | Dako | S3023 | |
| Suero de cabra normal | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 celdas | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldehído | Sigma | Cat. 158127 | |
| trietoxisilano | Sigma | Cat. Nº 390143 | |
| tripsina-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
Referencias
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326(2013).
- Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is req....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
