Detección en tiempo real de la producción reactiva de especies de oxígeno en la respuesta inmune en el arroz con un ensayo de quimioluminiscencia

Resumen

Aquí, describimos un método para la detección en tiempo real de la producción de especies reactivas de oxígeno apoplásico (ROS) en tejidos de arroz en la respuesta inmune desencadenada por patrones moleculares asociados a patógenos. Este método es simple, estandarizado y genera resultados altamente reproducibles en condiciones controladas.

Resumen

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) desempeñan un papel vital en una variedad de procesos biológicos, incluida la detección de estreses abióticos y bióticos. Tras la infección del patógeno o el desafío con productos químicos asociados a patógenos (patrones moleculares asociados a patógenos [PAMP]), se induce rápidamente una serie de respuestas inmunes, incluida una explosión de ROS, en las plantas, lo que se denomina inmunidad activada por PAMP (PTI). Una explosión de ROS es una respuesta PTI distintiva, que es catalizada por un grupo de NADPH oxidasas localizadas en la membrana plasmática, las proteínas de la familia RBOH. La gran mayoría de las ROS comprenden peróxido de hidrógeno (_H2O2), que puede detectarse fácil y constantemente mediante un método de quimioluminiscencia basado en luminol. La quimioluminiscencia es una reacción productora de fotones en la que el luminol, o su derivado (como L-012), sufre una reacción redox con ROS bajo la acción de un catalizador. Este documento describe un método optimizado de quimioluminiscencia basado en L-012 para detectar la producción de ROS de apoplast en tiempo real tras la obtención de PAMP en tejidos de arroz. El método es fácil, estable, estandarizado y altamente reproducible bajo condiciones firmemente controladas.

Introducción

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) comprenden una serie de derivados de oxígeno químicamente activos, incluidos los radicales aniónicos superóxido (_O2-) y sus derivados, radicales hidroxilo ^(OH-), peróxido de hidrógeno y productos de oxígeno singlete o reacciones de ^{oxidación-reducción}, que se producen constantemente en plastidios y cloroplastos, mitocondrias, peroxisomas y otras ubicaciones subcelulares¹ . Las ROS juegan un papel importante en muchos procesos biológicos y son esenciales para todas las plantas ^2,3,4

Protocolo

NOTA: El protocolo es aplicable a diferentes tejidos vegetales. La vaina de arroz y los discos de hoja se utilizaron en este protocolo para la detección de ROS tras la obtención de PAMP. Dado que las diferencias surgen principalmente debido al método de muestreo, a continuación sólo se describen los procedimientos comunes, y se mencionan medidas específicas cuando sea necesario.

1. Cultivo vegetal

1. Esterilizar las semillas de arroz descascarilladas con etanol al 70% durante 1 min, luego con hipoclorito de sodio al 40% (NaClO) durante 1 h. Luego, enjuague las semillas 5 veces con agua estéril para eliminar el cloro ....

Resultados

Aquí, tomamos el material de arroz como ejemplo para determinar las ROS producidas con el tratamiento flg22. La generación de ROS después de la obtención es transitoria. En el arroz, el aumento en la producción de ROS se detectó por primera vez en 1-2 min, alcanzó un máximo de 10-12 min y regresó a la línea de base en ~ 30-35 min (Figura 3). En comparación con la prueba de control, en la que PAMP estaba ausente en la solución de obtención que no resultaba en una inducción de ROS obvia, se in.......

Discusión

El propósito de este estudio fue establecer un método altamente eficiente para cuantificar la producción temprana de ROS en respuesta a PAMP en tejidos de arroz. Este método proporciona un procedimiento estandarizado para la determinación en tiempo real de ROS de apoplast producidas a partir de tejidos de arroz tratados. Este método es simple en operación, bajo en costo, claro en composición e independiente de los kits comerciales. Usando este método, los investigadores pueden estudiar la producción en tiempo real de ROS.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de microtitulación de 96 pocillos	WHB	WHB-96-01
Absoluto de etanol	Innochem	A43543
flg22	Sangon Biotech	p20973	PAMP
Gen5	BioTek		software
L-012	FUJIFILM	120-04891	8-amino-5-cloro-7-fenil-2,3-dihidropiridado [3,4-d] piridazina-1,4-diona, CAS #:143556-24-5
Lector de microplacas	BioTek	Synergy 2
MS Medium	Solarbio	M8521
NaCLO	Aladdin	S101636
Peroxidasa de rábano picante (HRP)	Sigma	P8375
Phytagel	Sigma	P8169
Sampler	Miltex	15110-40
Sacarosa	Sangon Biotech	A502792
Tris	Sangon Biotech	A610195