El presente protocolo describe un método eficiente para la adquisición dinámica y en tiempo real de corrientes de canal de potasio (Kv) dependientes de voltaje en cardiomiocitos H9c2 utilizando la técnica de pinza de parche de células enteras.
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Artículo de método
Registro de corriente de potasio dependiente del voltaje en cardiomiocitos H9c2 mediante la técnica de pinza de parche de células enteras
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Resumen
Resumen
Los canales de potasio en la membrana celular miocárdica juegan un papel importante en la regulación de las actividades electrofisiológicas celulares. Al ser uno de los principales canales iónicos, los canales de potasio dependientes de voltaje (Kv) están estrechamente asociados con algunas enfermedades cardíacas graves, como el daño miocárdico inducido por medicamentos y el infarto de miocardio. En el presente estudio, se empleó la técnica de patch-clamp de células enteras para determinar los efectos de 1,5 mM 4-aminopiridina (4-AP, un inhibidor de los canales de potasio de amplio espectro) y aconitina (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM y 200 μM) sobre la corriente del canal Kv (IKv) en cardiomiocitos H9c2. Se encontró que la 4-AP inhibió el I Kv en aproximadamente un 54%, mientras que el efecto inhibitorio de la CA sobre el IKv mostró una tendencia dependiente de la dosis (ningún efecto para 25 μM, tasa inhibitoria del 30% para 50 μM, tasa inhibitoria del 46% para 100 μM y tasa inhibitoria del 54% para 200 μM). Debido a las características de mayor sensibilidad y precisión, esta técnica promoverá la exploración de la cardiotoxicidad y los efectos farmacológicos de la etnomedicina dirigida a los canales iónicos.
Introducción
Los canales iónicos son proteínas integradas especiales incrustadas en la bicapa lipídica de la membrana celular. En presencia de activadores, los centros de tales proteínas integradas especiales forman poros hidrófilos altamente selectivos, permitiendo que iones de un tamaño y carga apropiados pasen a través de una manera de transporte pasivo1. Los canales iónicos son la base de la excitabilidad celular y la bioelectricidad y desempeñan un papel clave en una variedad de actividades celulares2. El corazón suministra sangre a otros órganos a través de contracciones regulares resultantes de un proceso acoplado excitación-c....
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Protocolo
Los cardiomiocitos de rata H9c2 obtenidos comercialmente (ver la Tabla de materiales) se incubaron en DMEM que contenía 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C en una atmósfera humidificada deCO2 al 5%. La técnica de patch-clamp de células enteras se empleó para detectar los cambios en IKv en células H9c2 normales y células tratadas con 4-AP o CA (Figura 1 y Figura 2).
1. Preparación de la solución
- Prepare el medio de cultivo celular DMEM que contenga 10% de FBS ....
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Resultados
Este protocolo permitió el registro del IKv de acuerdo con los parámetros establecidos en la técnica de patch-clamp de células enteras. El IKv fue activado por 150 ms de estímulo de pulso despolarizante de -40 a +60 mV a un potencial de retención de -60 mV (Figura 3A). El IKv de los cardiomiocitos de rata H9c2 apareció por primera vez alrededor de -20 mV, y luego la amplitud aumentó con una mayor despolarización. La relación media entre el IKv y el.......
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Discusión
La técnica electrofisiológica patch-clamp se utiliza principalmente para registrar y reflejar la actividad eléctrica y las características funcionales de los canales iónicos en la membrana celular25. En la actualidad, los principales métodos de grabación de la técnica patch-clamp incluyen la grabación de un solo canal y la grabación de célulascompletas 26. Para el modo de celda completa, el microelectrodo de vidrio y la presión negativa se utilizan para formar un sello de a.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82130113) y el Programa Clave de Investigación y Desarrollo y Transformación del Departamento de Ciencia y Tecnología de la provincia de Qinghai (2020-SF-C33).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 4-Aminopiridina | Sigma | MKCJ2184 | |
| Aconitine | Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd | DSTDW000602 | |
| Amplificador | Axon Instrument | MultiClamp 700B | |
| Balanza analítica | Sartorius | 124S-CW | |
| ATP Na2 | Solarbio | 416O022 | |
| Vidrio de borosilicato con filamento (diámetro exterior: 1,5 mm, diámetro interior: 1,10 mm, 10 cm de longitud) | Instrumento Sutter | 163225-5 | |
| Plato de cultivo celular (100 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Plato de cultivo celular (35 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 3012022 | |
| Clampex software | Molecular Devices, LLC. | Versión 10. 5 | |
| Software Clampfit | Molecular Devices, LLC. | Versión 10. 6. 0. 13 | software |
| de adquisición de datos D-(+)-glucosa | Rhawn | RH289133 | |
| Cámara digital | Hamamatsu | C11440 | |
| Digitizador | Axon Instrument | Axon digidata 1550B | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco | 8121587 | |
| EGTA | Biofroxx | EZ6789D115 | |
| Suero fetal bovino | Gibco | 2166090RP | |
| Extractor de micropipetas Flamígero/marrón | Sutter Instrument Modelo | P-1000 | |
| Células H9c2 | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0111 | |
| HCImageLive | Hamamatsu | 4.5.0.0 | |
| HCl | Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd | 2106081 | |
| HEPES | Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd | 20210221 | |
| KCl | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020082501 | |
| KOH | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020112601 | |
| MgCl2 | Tianjin Guangfu Instituto de Investigación de Química Fina | 20160408 | |
| MgCl2· 6H2O | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2021020101 | |
| Micromanipulador | Sutter Instrument | MP-285A | |
| Microscopio | Olympus | IX73 | |
| Cubreobjetos de microscopio (20 y veces; 20 mm) | Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd | 80340-0630 | |
| Milli-Q | Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd | Milli-Q IQ 7005 | |
| MultiClamp 700B | comandante Axon Instrument | MultiClamp 2.0 | software de amplificador de señal |
| Software OriginPro 8 | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicilina-Estreptomicina (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| PH medidor | Mettler Toledo | S201K | |
| Solución salina tamponada con fosfato (1x) | Gibco | 8120485 | |
| Tripsina 0,25% (1x) | HyClone | J210045 |
Referencias
- Luan, Q. H. Passive transport and ion channels in biofilms. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Intramongoljcae. 2, 215-235 (1984).
- Lei, M., Sun, S. Advances in the mechanism of arrhythmia induced by sodium channel disease. <....
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Reimpresiones y permisos
