マウス脳脊髄液中のグルコース濃度上昇のための浸透圧ミニポンプ植込み
Summary
この記事では、マウスの脳脊髄液(CSF)中のグルコース濃度を高めるための詳細なプロトコルについて説明します。このアプローチは、マウスの神経変性、認知、および末梢グルコース代謝に対する高CSFグルコースの影響を研究するのに役立ちます。
Abstract
糖尿病は認知機能低下のリスクを高め、脳機能を損ないます。高血糖と認知障害の間のこの関係が因果関係であるかどうかは、とらえどころのないままです。さらに、これらの欠損が脳脊髄液(CSF)および/または血液中のグルコースレベルの上昇によって媒介されるかどうかも不明である。現在の糖尿病モデルはそのような研究課題に対処するのに十分に開発されていないため、中枢神経系(CNS)機能、特に学習と記憶に対する高CSFグルコースレベルの直接的な影響を調査した研究はほとんどありません。本稿では、マウスの浸透圧ミニポンプを用いて側脳室にグルコースを連続的に注入することにより、CSFグルコースレベルを4週間慢性的に上昇させる方法について述べる。プロトコルは、CSF中のグルコースレベルを測定することによって検証された。このプロトコルは、人工脳脊髄液(aCSF)を投与されたマウスのCSFグルコース濃度~56 mg/dLと比較して、0.25 μL/hの流速で50%グルコース溶液を注入した後、CSFグルコースレベルを~328 mg/dLに増加させました。さらに、このプロトコルは血糖値に影響を与えませんでした。したがって、この方法は、血糖値の変化とは無関係に、脳機能または特定の神経経路に対する高CSFグルコースの直接的な影響を決定するために使用することができる。全体として、ここで説明するアプローチは、アルツハイマー病および/または糖尿病に関連する他の神経変性疾患の特徴を媒介する高CSFグルコースの役割をテストするための動物モデルの開発を促進します。
Introduction
1型糖尿病と2型糖尿病の両方が脳機能を損ないます1,2,3。例えば、糖尿病は認知機能低下やアルツハイマー病を含む神経変性疾患のリスクを高めます3,4。さらに、糖尿病患者は脳内のグルコース感知に欠陥があります5,6。この欠陥は、低血糖に関連する無意識の病因と低血糖に対する不十分な逆調節応答に寄与します7,8、これはすぐに治療しないと致命的となる可能性があります。
糖尿病は血液および脳脊髄液(CSF)9中のグルコースレベルを上昇させることを考慮すると、これらの要因の一方または両方が脳機能障害に寄与するかどうかを判断することが重要です。糖尿病が高CSFグルコースのみによって脳損傷を引き起こすのか、インスリン欠乏症やインスリン抵抗性などの他の要因と組み合わせて脳損傷を引き起こすのかも未解決の問題です。1型および2型糖尿病の動物モデルは、影響を受けたエネルギーバランスおよび末梢グルコース代謝に加えて、認知機能低下および神経変性を示す10、11、12、13。しかし、これらのモデルから、脳機能に対する糖尿病の合併症を媒介する際の高CSFグルコース対血糖値の選択的効果を切り離すことは現実的ではない。
このプロトコルは、脳機能、エネルギーバランス、およびグルコース恒常性に対する慢性的に高いCSFグルコースレベルの影響をテストするために、高グリコラキアのマウスモデルを開発する方法を説明しています。この技術によって開発されたマウスモデルは、神経および行動機能に対する調節不全のグルコース恒常性の病因学的役割を調査するための研究のためのツールを提供します。
したがって、提案されたアプローチは、さまざまな病態生理学的条件におけるCSFグルコースレベルの上昇の直接的な影響を理解するのに役立ちます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、側脳室に埋め込まれたカニューレに接続された浸透圧ミニポンプを使用して、マウスのCSFグルコースを増加させるための詳細なプロトコルを報告します。この手順によるマウス脳へのグルコースの慢性注入は、認知、全身のグルコース代謝、およびエネルギーバランスに対する長期高グリコラキアの影響を描写し、糖尿病合併症の病因をよりよく理解するのに役立ちます。
…Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
国立衛生研究所はKHCにDK124619を付与します。
ニューヨーク州ロチェスター大学医学部のスタートアップ資金とパイロット研究賞をKHCに授与。
ロチェスター大学デルモンテ神経科学研究所パイロット研究賞をKHCに授与。
ニューヨーク州ロチェスター大学研究担当副学長室の大学研究賞をKHCに授与。
MURは、メソッドを設計および実行し、結果を分析して、グラフと図を作成し、原稿を作成および編集しました。KHCは研究の構想と監督、結果の分析、原稿の執筆と編集を行いました。KHCはこの作品の保証人です。すべての著者が原稿の最終版を承認した。
Materials
| 0.22 µm syringe filter | Membrane solutions | SFPES030022S | |
| 1 mL sterile Syringe (Luer-lok tip) | BD | 309628 | |
| 1 mL TB syringe | BD | 309659 | |
| 100 mL Glass beaker | Fisher | N/a | |
| 100% Ethanol (Koptec) | DLI | UN170 | Use 70% dilution to clean the surgery area |
| 50 mL conical tube | Fisher | N/A | |
| Allignment indicator | KOPF | 1905 | |
| Alzet brain infusion kit | DURECT | Kit # 3; 0008851 | Cut tubing in the kit to 1 inch length |
| Alzet osmotic pump | DURECT | 2004 | Flow rate 0.25 µL/h |
| Anesthesia system | Kent Scientific | SomnoSuite | |
| Betadine solution | Avrio Health | N/A | |
| CaCl2 . 2H2O | Fisher | C79-500 | |
| Cannula holder | KOPF | 1966 | |
| Centering scope | KOPF | 1915 | |
| Dental Cement Liquid | Lang Dental | REF1404 | |
| Dental cement Powder | Lang Dental | REF1220-C | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| Electric drill | KOPF | 1911 | While drilling a hole avoid rupturing dura mater |
| Eye lubricant (Optixcare) | CLC Medica | N/A | |
| Glass Bead sterilizer (Germinator 500) | VWR | 101326-488 | Place instruments in sterile water to let them cool before surgery |
| Glucose Assay Kit | Cayman chemical | 10009582 | |
| H2O2 | Sigma | H1009-500ml | Apply 3% H2O2 on skull surface to make the cranial sutures visible. |
| Hair Clipper | WAHL | N/A | |
| heating pad | Heatpax | 19520483 | |
| Hemostat | N/A | N/A | |
| Isoflurane (Fluriso) | Zoetis | NDC1385-046-60 | |
| KCl | VWR | 0395-500g | |
| Magnetic stand | WPI | M1 | |
| Magnifying desk lamp | Brightech | LightView Pro Flex 2 | |
| Metal Spatula | N/A | N/A | |
| MgCl2 . 6H2O | Fisher | BP214-500 | |
| Micromanipulator (Right handed) | WPI | M3301R | |
| Micromanipulator with digital display | KOPF | 1940 | |
| Na2HPO4 . 7H2O | Fisher | S373-500 | |
| NaCl | Sigma | S7653-5Kg | |
| NaH2PO4 . H2O | Fisher | S369-500 | |
| Neosporin | Johnson & Johnson | N/A | Apply topical oinment to prevent infection |
| Parafilm | Bemis | DM-999 | |
| Rimadyl (Carprofen) 50mg/ml | Zoetis | N/A | 5 mg/kg, subcutaneous, for analgesia |
| Scalpel | N/A | N/A | |
| Stereotaxic allignment system | KOPF | 1900 | |
| Sterile 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| Sterile cotton tip applicators (Solon) | AMD Medicom | 56200 | |
| Sterile nylon sutures (5.0) | Oasis | MV-661 | Use non-absorable suture for closing the wound |
| Sterile sharp scissors | N/A | N/A | |
| Sterile surgical blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical gloves (Nitrile) | Ammex | N/A | Change gloves if there is suspision of contamination |
| Tray | N/A | N/A |
Referencias
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