Este artículo describe un protocolo detallado para aumentar la concentración de glucosa en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de ratones. Este enfoque puede ser útil para estudiar los efectos de la glucosa alta en LCR en la neurodegeneración, la cognición y el metabolismo periférico de la glucosa en ratones.
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Artículo de método
Implantación de minibomba osmótica para aumentar la concentración de glucosa en líquido cefalorraquídeo de ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
La diabetes aumenta el riesgo de deterioro cognitivo y afecta la función cerebral. Si esta relación entre la glucosa alta y los déficits cognitivos es causal sigue siendo difícil de alcanzar. Además, tampoco está claro si estos déficits están mediados por un aumento en los niveles de glucosa en el líquido cefalorraquídeo (LCR) y / o la sangre. Hay muy pocos estudios que investiguen los efectos directos de los niveles altos de glucosa en el LCR en la función del sistema nervioso central (SNC), especialmente en el aprendizaje y la memoria, ya que los modelos actuales de diabetes no están lo suficientemente desarrollados para abordar tales preguntas de investigación. Este artículo describe un método para aumentar crónicamente los niveles de glucosa en LCR durante 4 semanas mediante la infusión continua de glucosa en el ventrículo lateral utilizando minibombas osmóticas en ratones. El protocolo se validó midiendo los niveles de glucosa en LCR. Este protocolo aumentó los niveles de glucosa en LCR a ~ 328 mg / dL después de la infusión de una solución de glucosa al 50% a una velocidad de flujo de 0.25 μL / h, en comparación con una concentración de glucosa en LCR de ~ 56 mg / dL en ratones que recibieron líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF). Además, este protocolo no afectó los niveles de glucosa en sangre. Por lo tanto, este método se puede utilizar para determinar los efectos directos de la glucosa alta en LCR en la función cerebral o una vía neuronal específica independientemente de los cambios en los niveles de glucosa en sangre. En general, el enfoque descrito aquí facilitará el desarrollo de modelos animales para probar el papel de la glucosa alta en el LCR en la mediación de las características de la enfermedad de Alzheimer y / u otros trastornos neurodegenerativos asociados con la diabetes.
Introducción
Tanto la diabetes tipo 1 como la diabetes tipo 2 afectan la función cerebral 1,2,3. Por ejemplo, la diabetes aumenta el riesgo de deterioro cognitivo y trastornos neurodegenerativos, incluyendo la enfermedad de Alzheimer 3,4. Además, las personas con diabetes tienen una detección defectuosa de glucosa en el cerebro 5,6. Este defecto contribuye a la patogénesis de la hipoglucemia asociada al desconocimiento y a una respuesta contrarregulad....
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Protocolo
Todos los procedimientos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Rochester y se realizaron de acuerdo con las pautas del Servicio de Salud Pública de los Estados Unidos para el cuidado humanitario y el uso de animales de experimentación. Se obtuvieron comercialmente ratones machos C57BL / 6J de seis semanas de edad utilizados para este estudio. Todos los animales fueron alojados en grupo (5 ratones por jaula) en una habitación con un ciclo día/noche de 12 h y se les dio acceso a alimentos y agua ad libitum. Después de que a los ratones se les implantó una cánula para infundir glucosa en el ven....
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Resultados
A los ratones machos se les implantó una cánula ensamblada en una minibomba osmótica (Figura 1) para infundir crónicamente aCSF o una solución de glucosa al 50% en sus ventrículos laterales (Figura 2). El LCR se recolectó 10 días después de la cirugía (Figura 3) para validar la eficacia de este procedimiento. Los resultados mostraron un aumento en los niveles de glucosa en LCR (media: 327,7 mg / dL) en ratones infundidos con 50% de .......
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Discusión
Este artículo informa un protocolo detallado para aumentar la glucosa en LCR en ratones mediante el uso de minibombas osmóticas conectadas a una cánula implantada en el ventrículo lateral. La infusión crónica de glucosa en el cerebro del ratón a través de este procedimiento será útil para delinear los efectos de la hiperglicerrafia a largo plazo en la cognición, el metabolismo sistémico de la glucosa y el equilibrio energético y para comprender mejor la patogénesis de las complicaciones de la diabetes.
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.
Agradecimientos
Los Institutos Nacionales de Salud otorgan DK124619 a KHC.
Fondos iniciales y premio de investigación piloto, Departamento de Medicina, Universidad de Rochester, NY, a KHC.
Premio de Investigación Piloto del Instituto Del Monte para la Neurociencia, Universidad de Rochester, a KHC.
Premio de Investigación Universitaria, Oficina del Vicepresidente de Investigación, Universidad de Rochester, NY, a KHC.
MUR diseñó y realizó el método, analizó los resultados, preparó gráficos y figuras, y escribió y editó el manuscrito. KHC concibió y supervisó el estudio, anali....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,22 y micro; m filtro de jeringa | Soluciones de membrana | SFPES030022S | |
| 1 mL estéril Jeringa (punta Luer-lok) | BD | 309628 | |
| 1 mL Jeringa TB | BD | 309659 | |
| 100 mL Vaso de precipitados de vidrio | Fisher | N/a | |
| 100% Etanol (Koptec) | DLI | UN170 | Utilice una dilución al 70% para limpiar el área de la cirugía |
| Tubo cónico de 50 mL | Fisher | N/A Indicador | |
| de alineamiento | KOPF | 1905 | |
| Kit de infusión cerebral Alzet | DURECT | Kit # 3; 0008851 | Corte el tubo del kit a 1 pulgada de longitud |
| Bomba osmótica Alzet | DURECT | 2004 | Caudal 0,25 & L/h |
| Sistema de anestesia | Kent Scientific | SomnoSuite | |
| Betadine solution | Avrio Health | N/A | |
| CaCl2 . 2H2O | Fisher | C79-500 | |
| Soporte de cánula | KOPF | 1966 | |
| Visor de centrado | KOPF | 1915 | |
| Cemento dental líquido | Lang Dental | REF1404 | |
| Cemento dental en polvo | Lang Dental | REF1220-C | |
| D-glucosa | Sigma | G8270 | |
| Taladro eléctrico | KOPF | 1911 | Al perforar un orificio, evite la ruptura de la duramadre |
| Lubricante ocular (Optixcare) | CLC Medica | N/A | |
| Esterilizador de perlas de vidrio (Germinator 500) | VWR | 101326-488 | Coloque los instrumentos en agua estéril para que se enfríen antes de la cirugía |
| Kit de ensayo de glucosa | Cayman chemical | 10009582 | |
| H2O2 | Sigma | H1009-500ml | Aplique H2O2 al 3% en la superficie del cráneo para hacer visibles las suturas craneales. |
| Cortapelos | WAHL | N/A | |
| almohadilla térmica | Heatpax | 19520483 | |
| Hemostat | N/A | N/A | |
| Isoflurano (Fluriso) | Zoetis | NDC1385-046-60 | |
| KCl | VWR | 0395-500g | |
| Soporte magnético | WPI | M1 | |
| Lámpara de escritorio de aumento | Brightech | LightView Pro Flex 2 | |
| N/A | N/A | ||
| MgCl2 . 6H2O | Fisher | BP214-500 | |
| Micromanipulador (diestro) | WPI | M3301R | |
| Micromanipulador con pantalla digital | KOPF | 1940 | |
| Na2HPO4 . 7H2O | Fisher | S373-500 | |
| NaCl | Sigma | S7653-5Kg | |
| NaH2PO4 . H2O | Fisher | S369-500 | |
| Neosporin | Johnson & Johnson | N/A | Aplicar ungüento tópico para prevenir la infección |
| Parafilm | Bemis | DM-999 | |
| Rimadyl (Carprofeno) 50mg/ml | Zoetis | N/A | 5 mg/kg, subcutáneo, para analgesia |
| Bisturí | N/A | N/A | |
| Sistema de alineación estereotáxica | KOPF | 1900 | |
| Aguja estéril de calibre 27 | BD | 305109 | |
| Aplicadores estériles de punta de algodón (Solon) | AMD Medicom | 56200 | |
| Suturas estériles de nailon (5.0) | Oasis | MV-661 | Utilice una sutura no absorbente para cerrar la herida |
| Tijeras afiladas estériles | N/A | N/A | |
| Cuchillas quirúrgicas estériles | VWR | 55411-050 | |
| Guantes quirúrgicos (Nitrilo) | Ammex | N/A | Cambie los guantes si hay suspicacia de contaminación |
| Bandeja N/A | N/A |
Referencias
- Moheet, A., Mangia, S., Seaquist, E. R. Impact of diabetes on cognitive function and brain structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 1353, 60-71 (2015).
- Takeda, S., et al.
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Reimpresiones y permisos
