JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Traducción Automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biología

Stoma Soy Hücrelerinde Membran Kaçakçılığı Olaylarını İncelemek için Görüntü Tabanlı Yöntemler

Published: May 12, 2023
doi:
10.3791/65257
, ,
1Department of Biology,Rutgers University, 2Pharmacology and Toxicology Department,University of Arkansas for Medical Sciences

Summary

Bir plazma membran reseptörü kinazının membran kaçakçılığı olaylarını incelemek için burada yaygın olarak kullanılan birkaç yöntem tanıtılmaktadır. Bu yazıda bitki materyali hazırlama, farmakolojik tedavi ve konfokal görüntüleme kurulumu dahil olmak üzere ayrıntılı protokoller açıklanmaktadır.

Abstract

Ökaryotik hücrelerde, proteinler ve lipitler dahil olmak üzere zar bileşenleri, endomembran sistemi içindeki hedeflerine uzamsal olarak taşınır. Bu, yeni sentezlenen proteinlerin hücre yüzeyine veya hücrenin dışına salgı yoluyla taşınmasını, hücre dışı yüklerin veya plazma zarı bileşenlerinin hücre içine endositik taşınmasını ve yüklerin hücre altı organeller arasında geri dönüştürülmesini veya taşınmasını vb. içerir. Membran kaçakçılığı olayları, tüm ökaryotik hücrelerin gelişimi, büyümesi ve çevresel adaptasyonu için çok önemlidir ve bu nedenle sıkı düzenlemelere tabidir. Hücre dışı boşluktan ligand sinyallerini algılayan hücre yüzeyi reseptör kinazları hem salgı hem de endositik taşımaya uğrar. Plazma membranı lokalize lösin açısından zengin tekrar reseptör kinazı (ERL1) kullanarak membran kaçakçılığı olaylarını incelemek için yaygın olarak kullanılan yaklaşımlar burada açıklanmaktadır. Yaklaşımlar arasında bitki materyali hazırlama, farmakolojik tedavi ve konfokal görüntüleme kurulumu yer alır. ERL1’in uzay-zamansal regülasyonunu izlemek için bu çalışma, ERL1 ile bir multi-veziküler vücut belirteç proteini olan RFP-Ara7 arasındaki ko-lokalizasyon analizini, bu iki proteinin zaman serisi analizini ve membran kaçakçılığı inhibitörleri brefeldin A ve wortmannin ile tedavi edilen ERL1-YFP’nin z-yığın analizini açıklamaktadır.

Introduction

Membran trafiği, proteinler, lipitler ve diğer biyolojik ürünler dahil olmak üzere membran bileşenlerini (kargolar olarak da bilinir) ökaryotik bir hücre içindeki farklı organeller arasında veya plazma zarı boyunca hücre dışı boşluğa ve hücre dışı boşluğadağıtan korunmuş bir hücresel süreçtir 1. Bu süreç, nükleer zar, endoplazmik retikulum, Golgi aygıtı, vakuol/lizozomlar, plazma zarı ve çoklu endozomlardan oluşan endomembran sistemi adı verilen bir zar ve organeller topluluğu tarafından kolaylaştırılır1. Endomembran sistemi, bu organeller arasında mekik dokuyan dinamik veziküller kullanarak membran bileşenlerinin değiştirilmesini, paketlenmesini ve taşınmasını sağlar. Membran kaçakçılığı olayları, hücre gelişimi, büyümesi ve çevresel adaptasyonu için çok önemlidir ve bu nedenle sıkı ve karmaşık düzenlemeleretabidir 2. Şu anda, moleküler biyoloji, kimyasal biyoloji, mikroskopi ve kütle spektrometresinde çoklu yaklaşımlar geliştirilmiş ve membran kaçakçılığı alanına uygulanmıştır ve endomembran sisteminin uzay-zamansal regülasyonunun anlaşılmasını büyük ölçüde ilerletmiştir 3,4. Moleküler biyoloji, ilgilenilen proteinin gen ekspresyonunun değiştirilmesi veya ilgilenilen proteinin belirli etiketlerle etiketlenmesi gibi, membran kaçakçılığına dahil olan varsayılan oyuncuların klasik genetik manipülasyonları için kullanılır. Kimyasal biyolojideki araçlar, belirli yolların trafiğine özel olarak müdahale eden moleküllerin kullanımını içerir 4,5. Kütle spektrometresi, biyokimyasal yaklaşımlarla mekanik olarak izole edilmiş bir organeldeki bileşenleri tanımlamak için güçlüdür 3,4. Bununla birlikte, membran trafiği dinamik, çeşitli ve karmaşık bir biyolojik süreçtir1. Canlı hücrelerde membran kaçakçılığı sürecini çeşitli koşullar altında görselleştirmek için ışık mikroskobu önemli bir araçtır. Olayların verimliliğini, kinetiğini ve çeşitliliğini ölçmedeki zorlukların üstesinden gelmek için gelişmiş mikroskop tekniklerinde sürekli ilerleme kaydedilmiştir4. Burada, bu çalışma, doğal olarak basitleştirilmiş ve deneysel olarak erişilebilir bir sistem olan stoma gelişim sürecinde membran kaçakçılığı olaylarını incelemek için kimyasal/farmakolojik biyoloji, moleküler biyoloji ve mikroskopide yaygın olarak benimsenen metodolojilere odaklanmaktadır.

Stomalar, iç hücreler ve çevre arasındaki gaz alışverişini kolaylaştırmak için açılıp kapanan bitki hava yüzeylerindeki mikro gözeneklerdir 6,7,8. Bu nedenle stomalar, bitkinin hayatta kalması ve büyümesi için çok önemli olan iki olay olan fotosentez ve terleme için gereklidir. Stoma gelişimi, bitkinin çevreye adaptasyonunu optimize etmek için çevresel ipuçlarıyla dinamik olarak ayarlanır9. 2002 yılındaki çalışmalara dayanan reseptör proteini Too Many Mouths’un (TMM) tanımlanması, model bitki Arabidopsis thaliana10’da stoma gelişiminin moleküler mekanizmalarını araştırmak için yeni bir çağın kapısını açtı. Sadece birkaç on yıl sonra, klasik bir sinyal yolu tanımlandı. Yukarı akıştan aşağı akışa kadar, bu yol, epidermal modelleme faktörleri (EFP) ailesinde bir grup salgı peptit ligandı, EREECTA (ER) ailesinde birkaç hücre yüzeyi lösin açısından zengin tekrar (LRR) reseptör kinazları, LRR reseptör proteini TMM, bir MAPK kaskad ve SUSKUN (SPCH), DILSIZ, FAMA ve SCREAM (SCRM) dahil olmak üzere birkaç bHLH transkripsiyon faktörü içerir11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Önceki çalışmalar, reseptör kinazlardan biri olan ER-LIKE 1’in (ERL1), EPF algısı20 üzerine aktif hücre altı davranışlar gösterdiğini göstermektedir. ERL2 ayrıca plazma zarı ile bazı hücre içi organeller arasında dinamik olarak trafik yapar27. Membran kaçakçılığı adımlarının bloke edilmesi, anormal stoma desenlenmesine neden olarak yaprak yüzeyinde stoma kümelerine neden olur28. Bu sonuçlar, membran trafiğinin stoma gelişiminde önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Bu çalışma, bazı membran kaçakçılığı inhibitörleri kullanılarak farmakolojik tedavi ile birlikte protein-protein hücre altı ko-lokalizasyon analizi kullanılarak ERL1 dinamiklerini uzay-zamansal olarak araştırmak için bir protokolü açıklamaktadır.

Protocol

1. Çözeltilerin hazırlanması 15 mL ağartıcıyı 35 mL damıtılmış su ve 50 μL Triton X-100 ile karıştırarak tohum sterilizasyon solüsyonu hazırlayın. BFA tozunu etanol içinde 10 mM’lik (stok) nihai konsantrasyona çözerek brefeldin A (BFA) çözeltisini hazırlayın. Wm tozunu DMSO içinde 10 mM’lik (stok) nihai konsantrasyona çözerek wortmannin (Wm) çözeltisini hazırlayın. 2. Tohumların ekilmesi Ger…

Representative Results

Önceki bir çalışma, ERL1’in dinamik membran kaçakçılığı olaylarına maruz kalan aktif bir reseptör kinazolduğunu göstermiştir 20. ERL1, plazma membranı üzerinde bir transmembran LRR reseptör kinazdır. Endoplazmik retikulumda yeni sentezlenen ERL1, Golgi cisimciklerinde işlenir ve daha sonra plazma zarına taşınır. Plazma zarındaki ERL1 molekülleri, hücre dışı LRR alanlarını18 kullanarak EPF ligandlarını algılayabilir. EPF1 dahil olmak üzere…

Discussion

Endomembran sistemi, ökaryotik bir hücrenin sitoplazmasını farklı bölmelere ayırır ve bu da bu organellerin özel biyolojik işlevini sağlar. Kargo proteinlerini ve makromolekülleri nihai varış yerlerine doğru zamanda ulaştırmak için, çok sayıda vezikül bu organeller arasında mekik dokumak üzere yönlendirilir. Yüksek düzeyde düzenlenmiş membran kaçakçılığı olayları, hücrelerin canlılığında, gelişmesinde ve büyümesinde temel roller oynar. Bu önemli ve karmaşık süreci düzenleye…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı (IOS-2217757) (X.Q.) ve Arkansas Üniversitesi Tıp Bilimleri (UAMS) Bronson Vakfı Ödülü (H.Z.) tarafından desteklenmiştir.

Materials

10 mL syringes VWR BD309695 Vacuum samples
Brefeldin A (BFA) Sigma B7651 membrane trafficking drug
Confocal Microscope Leica Lecia SP8 TCS with LAS-X software package Imaging
Dissecting Forceps VWR 82027-402 Genetic cross
Fiji NIH https://imagej.net/Fiji Image processing
Leica LAS AF software Leica http://www.leica-microsystems.com Image processing
transgenic seeds of ERL1-YFP Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgenic seeds of RFP-Ara7 Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm) Sigma W1628 membrane trafficking drug
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Aniento, F., Sanchez de Medina Hernandez, V., Dagdas, Y., Rojas-Pierce, M., Russinova, E. Molecular mechanisms of endomembrane trafficking in plants. Plant Cell. 34 (1), 146-173 (2022).
  2. Sigismund, S., et al. Endocytosis and signaling: Cell logistics shape the eukaryotic cell plan. Physiological Reviews. 92 (1), 273-366 (2012).
  3. Lyu, Z., Genereux, J. C. Methodologies for measuring protein trafficking across cellular membranes. ChemPlusChem. 86 (10), 1397-1415 (2021).
  4. Rodriguez-Furlan, C., Raikhel, N. V., Hicks, G. R. Merging roads: Chemical tools and cell biology to study unconventional protein secretion. Journal of Experimental Botany. 69 (1), 39-46 (2017).
  5. Foissner, I., Sommer, A., Hoeftberger, M., Hoepflinger, M. C., Absolonova, M. Is wortmannin-induced reorganization of the trans-Golgi network the key to explain charasome formation. Frontiers in Plant Science. 7, 756 (2016).
  6. Qi, X., Torii, K. U. Hormonal and environmental signals guiding stomatal development. BMC Biology. 16 (1), 21 (2018).
  7. Han, S. K., Kwak, J. M., Qi, X. Stomatal lineage control by developmental program and environmental cues. Frontiers in Plant Science. 12, 751852 (2021).
  8. Bharath, P., Gahir, S., Raghavendra, A. S. Abscisic acid-induced stomatal closure: An important component of plant defense against abiotic and biotic stress. Frontiers in Plant Science. 12, 615114 (2021).
  9. Becklin, K. M., Ward, J. K., Way, D. A. . Photosynthesis, Respiration, and Climate Change., 1st edition. , (2021).
  10. Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
  11. Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
  12. Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
  13. Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
  14. Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
  15. Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
  16. Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
  17. Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
  18. Lin, G., et al. A receptor-like protein acts as a specificity switch for the regulation of stomatal development. Genes & Development. 31 (9), 927-938 (2017).
  19. Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
  20. Qi, X., et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, e58097 (2020).
  21. MacAlister, C. A., Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Transcription factor control of asymmetric cell divisions that establish the stomatal lineage. Nature. 445 (7127), 537-540 (2007).
  22. Pillitteri, L. J., Sloan, D. B., Bogenschutz, N. L., Torii, K. U. Termination of asymmetric cell division and differentiation of stomata. Nature. 445 (7127), 501-505 (2007).
  23. Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Arabidopsis FAMA controls the final proliferation/differentiation switch during stomatal development. Plant Cell. 18 (10), 2493-2505 (2006).
  24. Kanaoka, M. M., et al. SCREAM/ICE1 and SCREAM2 specify three cell-state transitional steps leading to Arabidopsis stomatal differentiation. Plant Cell. 20 (7), 1775-1785 (2008).
  25. Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304 (5676), 1494-1497 (2004).
  26. Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19 (1), 63-73 (2007).
  27. Ho, C. M., Paciorek, T., Abrash, E., Bergmann, D. C. Modulators of stomatal lineage signal transduction alter membrane contact sites and reveal specialization among ERECTA kinases. Developmental Cell. 38 (4), 345-357 (2016).
  28. Le, J., et al. Auxin transport and activity regulate stomatal patterning and development. Nature Communications. 5, 3090 (2014).
  29. Geldner, N., et al. The Arabidopsis GNOM ARF-GEF mediates endosomal recycling, auxin transport, and auxin-dependent plant growth. Cell. 112 (2), 219-230 (2003).
  30. Qi, X., et al. Autocrine regulation of stomatal differentiation potential by EPF1 and ERECTA-LIKE1 ligand-receptor signaling. Elife. 6, 24102 (2017).
  31. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  32. Leighton, R. E., Alperstein, A. M., Frontiera, R. R. Label-free super-resolution imaging techniques. Annual Review of Analytical Chemistry. 15 (1), 37-55 (2022).
  33. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: Present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  34. Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), (2019).
  35. Nwaneshiudu, A., et al. Introduction to confocal microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 132 (12), (2012).
  36. Sanderson, J. Multi-photon microscopy. Current Protocols. 3 (1), 634 (2023).

Tags

Membrane TraffickingStomatal Lineage CellsCell BiologyMicroscopyConfocal ImagingReceptor KinaseERL1RFP-Ara7Plant AdaptationEnvironmental Stress

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
He, Q., Zhang, H., Qi, X. Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells. J. Vis. Exp. (195), e65257, doi:10.3791/65257 (2023).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image