Aquí se presenta un método para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras de oligodendrocitos del cerebro de ratas vivas en detalle experimental. Permite múltiples colecciones de estas células de los mismos animales sin comprometer su bienestar.
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Artículo de método
El método de "ordeño cerebral" para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras de oligodendrocitos de ratas vivas
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Resumen
Resumen
Las células madre neurales (NSC) específicas de tejido permanecen activas en el cerebro postnatal de los mamíferos. Residen en nichos especializados, donde generan nuevas neuronas y glía. Uno de estos nichos es la zona subependimaria (ZEE; también llamada zona ventricular-subventricular), que se encuentra a lo largo de las paredes laterales de los ventrículos laterales, adyacente a la capa de células ependimarias. Las células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) están abundantemente distribuidas por todo el sistema nervioso central, constituyendo un conjunto de células progenitoras proliferativas que pueden generar oligodendrocitos.
Tanto los NSC como los OPC exhiben potencial de autorrenovación y ciclos de inactividad/activación. Debido a su localización, el aislamiento y la investigación experimental de estas células se realiza post mortem. Aquí, describimos en detalle el "ordeño cerebral", un método para el aislamiento de NSCs y OPCs, entre otras células, de animales vivos. Este es un protocolo de dos pasos diseñado para su uso en roedores y probado en ratas. En primer lugar, las células se "liberan" del tejido a través de una inyección estereotáxica intracerebroventricular (i.c.v.) de un "cóctel de liberación". Los componentes principales son la neuraminidasa, que se dirige a las células ependimarias e induce la denudación de la pared ventricular, un anticuerpo bloqueante de la integrina-β1, y el factor de crecimiento de fibroblastos-2. En una segunda etapa de "recolección", se realizan biopsias líquidas de líquido cefalorraquídeo de la cisterna magna, en ratas anestesiadas sin necesidad de incisión.
Los resultados presentados aquí muestran que las células aisladas conservan su perfil endógeno y que las NSC de la ZEE conservan su quiescencia. La denudación de la capa ependimaria se restringe al nivel anatómico de la inyección y el protocolo (liberación y recolección) es bien tolerado por los animales. Este novedoso enfoque allana el camino para realizar estudios longitudinales de neurogénesis endógena y gliogénesis en animales de experimentación.
Introducción
Las células madre específicas de tejido son células parcialmente comprometidas que pueden dar lugar a todas las poblaciones celulares que constituyen los tejidos respectivos. Además de ser multipotentes, son células que se autorrenuevan y son cruciales para mantener la homeostasis y la capacidad regenerativa de los tejidos1. Algunas células madre específicas de tejido permanecen en un estado activo y fuertemente proliferativo, como las células madre intestinales o hematopoyéticas. Otras, como las células madre cerebrales, permanecen en gran medida inactivas o inactivas2. En el cerebro adulto, las células madre neurales (....
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Protocolo
Los procedimientos de cría, mantenimiento y experimentación de animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) del Reino Unido de 1986, autorizada por el Ministerio del Interior, y con el Decreto Presidencial 56/2013 de la República Helénica, examinada por los Órganos de Revisión Ética y de Bienestar Animal de las Universidades de Cambridge y Patras, así como aprobada y examinada por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Prefectura local (Número de protocolo: 5675/39/18-01-2021). Se utilizaron ratas macho y hembra Sprague-Dawley, Wistar y Long-Evans, con edades que variaban entre 2 y 4 meses y con pesos corporales ent....
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Resultados
Liberación y recopilación de NSC
Las NSC de la ZEE están separadas del LCR solamente por la monocapa de células ependimarias, aunque permanecen en contacto directo con el contenido ventricular a través de procesos monociliados intercalados 8,9. La neuraminidasa actúa específicamente sobre las células ependimarias a través de la escisión de los residuos de ácido siálico y puede inducir la denudación de la pared ventricular. Es.......
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Discusión
Las células madre y progenitoras son relativamente escasas en el tejido cerebral de los mamíferos. Además, las NSC se encuentran en áreas inaccesibles para realizar biopsias fáciles y seguras (paredes ventriculares, hipocampo). Por lo tanto, la única forma de trabajar experimentalmente con este tipo de células, hasta ahora, ha sido su aislamiento postmortem. A continuación se describe paso a paso un método que permite la recolección única o repetida de NSC y OPC de ratas vivas, llamado ordeño. El método se basa en dos ca.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos ni otros conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una beca de Action Medical Research (Reino Unido) (GN2291) a R.J.M.F. e I.K. El trabajo de investigación también fue parcialmente financiado (costos de animales y apoyo a D.D.) por la Fundación Helénica para la Investigación y la Innovación (H.F.R.I.) en el marco de la "Primera Convocatoria de Proyectos de Investigación H.F.R.I. para apoyar a los miembros de la Facultad e Investigadores y la adquisición de subvenciones para equipos de investigación de alto costo" (Número de proyecto: 3395).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| lanzamiento | |||
| y beta; Anticuerpo bloqueante de 1 integrina | BD Biosciences | #555002 | clon NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Ha2/5, 1 mg/mL. Cualquier cuerpo abntibody con actividad de bloqueo debe ser apropiado. |
| Neuraminidasa de Clostridium perfringens (Clostridium welchii) | Sigma-Aldrich | #N2876 | Las neuraminidasas de otras fuentes (por ejemplo, de Vibrio cholerae) no han sido probadas. |
| FGF humano recombinante básico (154 a.a.) | Peprotech | #100-18B | mantenido como un 1 μ g/μ L de caldo, diluido en agua estéril a -20 °C; C |
| Procedimientos quirúrgicos | |||
| 10 y micro; L Jeringa | Hamilton | #80330 | Modelo 701 RN, Aguja Pequeña Removible, Calibre 26s, 2 pulg., estilo de punta 2 |
| BD Jeringas de insulina microfinas de 1 mL | BD biosciences | 04085-00 | 29 G x 12.7 mm |
| BETADINE CUT. SOL 10% FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | SKU: | |
| Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL (buprenofina 0,3 mg/mL) |
| Digital Nuevo Estándar Estereotáxico, Ratas y Ratón | Stoelting | 51500D | |
| Sistema de Monitorización Homeotérmica | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| ISOFLURIN 1.000 mg/g vapor de inhalación, líquido | Vetpharma Salud Animal | 32509/4031 | |
| Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: | Ketamina 100 mg/mL |
| Sutura de nylon, Ethilon | Ethicon | D9635 | Transparente, tamaño 5-0 |
| Recortadoras quirúrgicas inalámbricas recargables | Stoelting | Artículo:51472 | |
| Hojas de bisturí, estériles | Swann Morton | AW050 | |
| Scopettes Jr. Hisopos de 8 pulgadas | Birchwood Laboratories | 34-7021-12P | |
| Taladro estereotáxico de alta velocidad | Foredom | 1474w/o1464 | |
| Stoelting' s Kit de Instrumento Estereotáxico Almacenamiento | Artículo | : 52189 | |
| Xylan 2% | Chanelle Pharmaceuticals | 13764/03/19-5-2004 | Xilacina, 25 |
| mLManipulación de tejidos y células e inmunotinciones | |||
| placas de 96 pocillos apropiadas para microscopía | Greiner | #655866 | Suplemento de microplaca de estrella de pantalla |
| B27 | ThermoFisher Scientific A1486701 | ||
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Merck | P06-1391100 | Fracción V, |
| térmico Merck | 71497 | Citrato de sodio monobásico | |
| Criostato | Leica | CM1510S | |
| DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | Tinción nuclear, dilución: 1/1.000 |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | Alto contenido de glucosa, piruvato |
| anti-cabra | Biotium | 20016 o 20106 o 20048 | Dilución: 1/1.000 |
| burro anti-ratón | Biotium | 20014 o 20105 o 20046 | Dilución: 1/1.000 |
| burro anti-conejo | Biotium | 20015 o 20098 o 20047 | Dilución: 1/1.000 |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FGF-2 (o bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| cabra anti-GFAP | Abcam | ab53554 | Dilución: 1/500 |
| cabra anti-SOX2 | Santa Cruz Biotecnology | sc-17320 | Dilución: 1/200 |
| ratón anti-ID3 | Santa Cruz Biotecnology | sc-56712 | Dilución: 1/200 |
| ratón anti-S100β | Sigma | S2532 | Dilución: 1/200 |
| Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 Medio de montaje | |
| N2 suplemento | ThermoFisher Scientific | ||
| Parafolmadehído | Merck | 158127 | |
| Poly-D-Lisina | Merck, Millipore | A-003-E | Solución, 1,0 mg/mL |
| anti-Doublecortin (DCX) | Abcam | ab18723 | Dilución: 1/500 |
| conejo anti-PDGFR&alfa; | Abcam | ab51875 | Dilución: 1/200 |
| conejo anti-β- catenina | Abcam | ab16051 | Dilución: 1/500 |
| Triton X-100 | Merck | X100 | |
| Microscopía y análisis de imágenes | |||
| Microscopio confocal | Leica | SP6 y SP8 | |
| Análisis de imágenes | NIH, EE. UU. | ImageJ | |
| Análisis de imagen | Leica | LasX |
Referencias
- Visvader, J. E., Clevers, H. Tissue-specific designs of stem cell hierarchies. Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).
- Dimitrakopoulos, D., Kakogiannis, D., Kazanis, I. Heterogeneity of quiescent and active neural stem cells in the postnatal....
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Reimpresiones y permisos
