La determinación de las unidades formadoras de colonias (UFC) es la técnica de referencia para cuantificar las bacterias, incluida la Mycobacterium tuberculosis , que puede tardar semanas en formar colonias visibles. Aquí describimos una micro-UFC para la determinación de UFC con mayor eficiencia de tiempo, menor espacio de laboratorio y costo de reactivos, y escalabilidad a experimentos de rendimiento medio y alto.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Ensayo de la unidad formadora de microcolonias para la evaluación de la eficacia de las vacunas contra la tuberculosis
En este artículo
Resumen
Resumen
La tuberculosis (TB), la principal causa de muerte en todo el mundo por un agente infeccioso, mató a 1,6 millones de personas en 2022, solo superada por la COVID-19 durante la pandemia de 2019-2021. La enfermedad es causada por la bacteria Mycobacterium tuberculosis (M.tb). La cepa de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), la única vacuna contra la tuberculosis, es la vacuna autorizada más antigua del mundo, todavía en uso. Actualmente, hay 12 vacunas en ensayos clínicos y docenas de vacunas en desarrollo preclínico. El método de elección utilizado para evaluar la eficacia de las vacunas contra la tuberculosis en estudios preclínicos es la enumeración de las colonias bacterianas mediante el ensayo de unidades formadoras de colonias (UFC). Este ensayo, que requiere mucho tiempo, tarda entre 4 y 6 semanas en concluir, requiere un espacio considerable en el laboratorio y la incubadora, tiene altos costes de reactivos y es propenso a la contaminación. Aquí describimos un método optimizado para la enumeración de colonias, la micro-UFC (mCFU), que ofrece una solución simple y rápida para analizar los resultados de eficacia de la vacuna M.tb . El ensayo mCFU requiere diez veces menos reactivos, reduce el período de incubación tres veces, tardando de 1 a 2 semanas en concluir, reduce el espacio de laboratorio y el costo de los reactivos, y minimiza los riesgos para la salud y la seguridad asociados con el trabajo con grandes cantidades de M.tb. Además, para evaluar la eficacia de una vacuna contra la tuberculosis, se pueden obtener muestras de diversas fuentes, incluidos tejidos de animales vacunados infectados con micobacterias. También describimos un método optimizado para producir un cultivo de micobacterias unicelular, uniforme y de alta calidad para estudios de infección. Por último, proponemos que estos métodos se adopten universalmente para los estudios preclínicos de determinación de la eficacia de las vacunas, lo que en última instancia conducirá a una reducción del tiempo en el desarrollo de vacunas contra la tuberculosis.
Introducción
La tuberculosis (TB) es la principal causa de muerte en todo el mundo por un solo agente infeccioso, la bacteria Mycobacterium tuberculosis (M.tb), que mata a más personas que cualquier otro patógeno. En 2021, la tuberculosis fue responsable de 1,6 millones de muertes y fue superada por la COVID-19 durante la pandemia de 2019-20211. Además, según el informe mundial sobre la tuberculosis de 2022 de la Organización Mundial de la Salud, la pandemia de COVID-19 fue responsable de un aumento de los nuevos casos de tuberculosis. La OMS también informa de grandes descensos en el número de personas diagnosticadas con tuberculosis dura....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
NOTA: El protocolo descrito aquí es para BCG, pero se puede aplicar a cualquier micobacteria. La BCG puede utilizarse como bacteria sustituta para experimentos de tuberculosis cuando no se dispone de instalaciones BSL322. Los siguientes procedimientos con BCG deben realizarse en un laboratorio de nivel de bioseguridad 2 (BSL2) y seguir las directrices de bioseguridad y las buenas prácticas de laboratorio adecuadas para la manipulación de microorganismos del grupo de riesgo 2.
1. Preparación de los medios de cultivo
- Prepare el caldo Middlebrook 7H9 suplementado con enriquecimiento de ácido o....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
El ensayo mCFU descrito aquí aumenta la cantidad de información que se puede recuperar de una sola placa de Petri a al menos 96 veces. En la figura 5 se muestra una comparación de dos métodos de administración de fármacos para el uso reutilizado de saquinavir (SQV)31,32 como fármaco dirigido al huésped para tratar la tuberculosis. En este ensayo, se utilizaron cuatro cepas diferentes de Mycobacterium tuberculosis para infect.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
La tuberculosis es un importante problema de salud pública con una importancia creciente, especialmente en los países de ingresos bajos y medios. La interrupción de los entornos sanitarios para diagnosticar y tratar la tuberculosis durante la pandemia de COVID-19 tuvo un impacto negativo en la incidencia de nuevos casos1. Además, las cepas de M.tb multirresistentes y ampliamente resistentes, así como la coinfección de M.tb y VIH, deben abordarse con urgencia para controlar esta e.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
DP y PJGB declaran que el estudio se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo contó con el apoyo de financiación interna de la Facultad de Medicina de la Universidad Católica Portuguesa y de la Fundación para la Ciencia y Tecnología (FCT), en el marco de las subvenciones UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 y EXPL/SAU-INF/0742/2021.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placas de 96 pocillos | VWR | 734-2781 | |
| Lente DSLR 15-55 mm | Nikon | AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR | |
| DSLR Cámara | Nikon | D3400 | |
| DSLR lente macro | Sigma | MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM | |
| Suero fetal de pantorrilla | Gibco | 10270106 | |
| Fiji Software | https://fiji.sc/ | Fiji es un software de código abierto respaldado por varios laboratorios, instituciones e individuos. Todos los plugins necesarios están incluidos. | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| L-glutamina | Gibco | 25030-081 | |
| Middlebrook 7H10 | BD | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 | BD | 271310 | |
| Pipeta multicanal (0,5 - 10 y micro; l) | Gilson | FA10013 | |
| Pipeta multicanal (20 - 200 y micro; l) | Gilson | FA10011 | |
| Mycobacterium bovis BCG | Colección de cultivos tipo americano | ATCC35734 | cepa TMC 1011 [BCG Pasteur] |
| Enriquecimiento de OADC | BD | ||
| solución salina tamponada con fosfato (PBS) | NZYTech | MB25201 | |
| RPMI 1640 medio | Gibco | 21875091 | |
| Piruvato de sodio | Gibco | 11360-070 | |
| Espectrofotómetro UV-6300PC | VWR | 634-6041 | |
| Placa de Petri cuadrada 120 x 120 mm | Corning | BP124-05 | |
| Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T8761 | |
| Baño de ultrasonidos Elma P 30 H | VWR | 142-0051 |
Referencias
- World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2022. , World Health Organization. Geneva. (2022).
- Bettencourt, P. J. G., Joosten, S. A., Lindestam Arlehamn, C. S., Behr, M. A., Locht, C., Neyrolles, O. 100 years of the Bacillus Calmette-Guérin vaccine. Vaccine. 39 (50), 7221-7222 (2021).
- Bettencourt, P. J. G.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
