Este protocolo presenta un método de aislamiento de cromatina específico de locus basado en la recombinación específica del sitio para purificar un locus de gen de una sola copia de interés en su contexto de cromatina nativa a partir de la levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae.
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Artículo de método
Purificación de cromatina del locus del gen de copia única en Saccharomyces cerevisiae
En este artículo
Resumen
Resumen
La unidad organizativa básica de la cromatina eucariota es la partícula del núcleo del nucleosoma (NCP), que comprende el ADN envuelto ~ 1,7 veces alrededor de un octámero de histonas. La cromatina se define como la entidad de los NCP y muchos otros complejos proteicos, incluidos los factores de transcripción, la remodelación de la cromatina y las enzimas modificadoras. Todavía no está claro cómo se orquestan estas interacciones proteína-ADN a nivel de loci genómicos específicos durante las diferentes etapas del ciclo celular. Esto se debe principalmente a las limitaciones técnicas actuales, que dificultan la obtención de mediciones precisas de dichas interacciones dinámicas. Aquí, describimos un método mejorado que combina la recombinación específica del sitio con un protocolo eficiente de purificación de afinidad de un solo paso para aislar un locus de interés de un gen de copia única en su estado nativo de cromatina. El método permite el enriquecimiento robusto del locus diana sobre la cromatina genómica, lo que convierte a esta técnica en una estrategia eficaz para identificar y cuantificar las interacciones de proteínas de forma imparcial y sistemática, por ejemplo, mediante espectrometría de masas. Además de estos análisis de composición, la cromatina nativa purificada por este método probablemente refleje la situación in vivo con respecto al posicionamiento de los nucleosomas y las modificaciones de las histonas y, por lo tanto, es susceptible de análisis estructurales y bioquímicos adicionales de la cromatina derivada de prácticamente cualquier locus genómico en la levadura.
Introducción
La organización dinámica de los genomas eucariotas en cromatina compacta el ADN para que quepa dentro de los confines del núcleo, al tiempo que garantiza una dinámica suficiente para la expresión génica y la accesibilidad para los factores reguladores. En parte, esta versatilidad está mediada por el nucleosoma, la unidad básica de la cromatina, que comprende una partícula central con 147 pb de ADN envuelto ~ 1,7 veces alrededor del octámerode histonas 1. El nucleosoma es una estructura altamente dinámica con respecto a su composición, con numerosas variantes de histonas y modificaciones postraduccionales (PTM) en las colas de histonas N- y C-te....
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Protocolo
Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales e instrumentos utilizados en este protocolo. Consulte la Tabla 1 para obtener una lista de las soluciones, los búferes y los medios utilizados.
1. Construcción de cepas de levadura recombinante
- Para construir una cepa de levadura competente para la recombinación, transforme el plásmido K238 digerido por SbfI en una cepa de levadura con sitios de unión a LexA integrados y sitios de recombinación RS en el locus de interés13,14.
NOT....
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Resultados
La purificación del dominio de cromatina ARS316 de ~1,4 kb fue mediada por la proteína adaptadora LexA-TAP expresada constitutivamente. Para que sirviera como control negativo, realizamos purificaciones utilizando una cepa isogénica que expresa LexA-TAP pero que no contiene sitios integrados de unión a RS y LexA. La Figura 3 ilustra el resultado del análisis de ADN de un experimento de purificación estándar realizado tanto en el control como en una cepa competente para la recombinación dirig.......
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Discusión
La identificación de los factores y el panorama de la cromatina de una región genómica diana específica sigue planteando un reto importante en la investigación de la cromatina18. Este protocolo describe un sistema eficiente para extirpar y purificar específicamente distintos dominios de cromatina de los cromosomas de levadura. Hasta donde sabemos, la pureza y el rendimiento de esta purificación en un solo paso superan muchas de las limitaciones de los métodos de purificación de cromatina específic.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
El trabajo en el laboratorio de S.H. contó con el apoyo de la DFG a través de SFB1064 (ID de proyecto 213249687), el Consejo Europeo de Investigación (ERC Starting Grant 852798 ConflictResolution) y la Helmholtz Gesellschaft.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Levadura fuerte | |||
| Control: MATa; ura3 y Delta; 0; leu2 y Delta; 0; his3Δ 1; met15 y Delta; 0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | Sección 1, ver referencias 13 y 14 | ||
| Recombination Strain: MATa; ura3Δ 0; leu2 y Delta; 0; his3Δ 1; met15 y Delta; 0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | Sección 1, ver referencia 13 y 14 | ||
| Plasmidio fuerte> | |||
| K238 | C | ||
| K071 ADN | Sección 7.1, ver referencia 13 Almacenamiento: Almacenar a -20 & grados; C | ||
| Reactivos | |||
| Acetona | Carl Roth | 5025.1 | Sección 2 Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Acetato de amonio (NH4Ac) | Sigma Aldrich | A7262 | Sección 6 y 7.1 Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Solución de amonio (NH4OH) 25% | Merck Millipore | 533003 | Sección 6 Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Sulfato de amonio | Santa Cruz | Sc-29085 | Sección 2 Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Bacto agar | BD (VWR) | 90000-760 | Sección 3 Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Bacto peptona | BD (VWR) | 211820 | Sección 3 Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 07604 | Sección 7.2 Almacenamiento: Almacenar a 4 & grados; C |
| Kit de sustrato quimioluminiscente | ThermoFisher | 34580 | Sección 7.2 Almacenamiento: Almacenar a 4 & grados; C |
| Hidrogenofosfato disódico dodecahidratado | Merck | 1.06579.1000 | Sección 2 y 7.1 Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Ditiothreitol (DTT) | ThermoFisher | 15508013 | Sección 4 Almacenamiento: Almacenamiento a 4 & grados; C |
| Etanol | Merck | 100983 | Sección 7.1 Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | Sigma Aldrich | ED | Sección 7.1 Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Galactosa (20% (p/v) stock) | Sigma Aldrich | G0625-1KG / 5KG | Sección 3 Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Gel Tinte de carga (6x) | BioLabs | B7024A | Sección 7.1 Almacenamiento: Almacenar a -20 & grados; C |
| Glucosa | Sigma-Aldrich | G8270 | Sección Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Glicina | Carl | Roth.0079.4 | Sección 2 Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Glucógeno (5 mg/mL) | Invitrogen | AM9510 | Sección 7.1 Almacenamiento: Almacenamiento a -20 &0 grados; C |
| Ácido clorhídrico (HCl) | PanReac AppliChem | 182109.1211 | Sección 2, 4 y 7.1 Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Acetato de magnesio (MgAc) | Bernd Kraft | 15274.2600/C035 | Sección 4 Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Cloruro de magnesio (MgCl2) | Sigma Aldrich | M8266 | Sección 6 Almacenamiento: Almacenar a temperatura ambiente |
| Tampón de muestra Nu PAGE LDS (4x) | Invitrogen | 2399549 | Sección 7.2 Almacenamiento: Almacenar a temperatura ambiente |
| Fenol/Cloroformo/Alcohol isoamílico (25:24:1 v/v) | Invitrogen | 15593-031 | Sección 7.1 Almacenamiento: Almacenar a 4 & grados; C |
| Cloruro de potasio (KCl) | Sigma | P9541 | Sección 4 Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Marcado radiactivamente &alfa;-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL) | Hartmann Analytic | SRP-203 | Sección 7.1 Almacenamiento: Almacenar a 4 & grados; C |
| Sistema de etiquetado RadPrime | ThermoFisher | 18428-011 | Sección 7.1 Almacenamiento: Almacenar a -20 & grados; C |
| Rafinosa (20% (p/v) de existencias) | SERVA | 34140.03 | Sección 3 Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Merck | K53710504142 | Sección 7.1 Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Citrato de sodio (Na3C6H5O7) | Sigma-Aldrich | 71402 | Sección 7.1 Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Hidróxido de sodio (NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | Sección 7.1 Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| N-dodecil sulfato de sodio (SDS) (5% de existencias (p/v) | Alfa Aesar | A11183 | Sección 7.1 Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Fosfato de sodio monobásico | Sigma-Aldrich | 71496 | Sección 2 y 7.1 Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Sodio azida Santa | Cruz Biotecnología | sc-208393 | Sección 2 Almacenamiento: Almacenar a -20 ° C |
| Trietilamina | Sigma Aldrich | 90340 | Sección 2 Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Tris base | Chem Cruz | SC-3715B | Sección 2 y 4 Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | Sección 2 y 4 Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Tween-20 | Bernd Kraft | 18014332 | Sección 4 Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Extracto de levadura | BD (VWR) | 212720 | Sección 3 Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Factor de apareamiento de levadura alfa (1 µ g/mL de existencias ) | Biomol | Y2016.5 | Sección 3 Almacenamiento: Almacenar a -20 &00 grados; C |
| Levadura Sintética Drop-out medio Suplementos sin LEUCINA | Sigma | Aldrich Y1376 | Sección 1, ver referencia 14 |
| fuertes | |||
| (5,000 U/mL) | NEB | R0105S | Sección 7.1 Almacenamiento: Almacenar a -20 ° |
| Cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa C (100x) | ThermoFisher Scientific | 78446 | Sección 4 Almacenamiento: Almacenar en4 ° C |
| Proteinasa K (10 mg/mL) | SERVA | 33756 | Sección 7.1 Almacenamiento: Almacenar a -20 &0 grados; |
| C RNasa A (10 mg/mL) | ThermoFisher | EN0531 | Sección 7.1 Almacenamiento: Almacenar a -20 & grados; C |
| TEV proteasa (10000 U/µ L) | NEB | P8112S | Sección 5 Almacenamiento: Almacene a -20 ° C |
| Materials | |||
| BcMag Epoxy-Activated Magnetic Beads | Bioclone Inc. | FC-102 | Sección 2 Almacenamiento: Almacenar a 4 & grados; C |
| Hielo | Sección 4 | ||
| Tubos de centrífuga de baja ligereza 2,0 mL | Eppendorf | 22431102 | Sección 4 |
| Microspin G-25 Columnas | Cytiva | 27-5325-01 | Sección 7.1 Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Parafilm | Merck | P7793 | Sección 4 |
| Membrana de nylon positivo | Biozol | 11MEMP0001 | Sección 7.1 Almacenamiento: Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Membrana de transferencia de PVDF | Immobilon-Merck Millipore | IPVH00010 | Sección 7.2 Almacenamiento: Almacenamiento en la habitación temperatura |
| SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 pocillos, 1,5 mm) | Invitrogen | NP0336BOX | Sección 7.2 Almacenamiento: Almacene a 4 & grados; C |
| Jeringa (25 mL) con luer | São Sass Wolf | 4200-000V0 | Sección 3 |
| Papel Whatman (Hoja de papel Western Blotting de celulosa CHR de grado 3 mm) | Cytiva | 3030-917 | Sección 7.1 Almacenamiento: Almacenar a temperatura ambiente |
| AnticuerposAnti-LexA | |||
| ADN | Merck Millipore | 06-719 | Sección 7.2 Almacenamiento: Almacenar a -20 &20 ° C |
| Cabra Anti-Conejo IgG (H + L), Rábano picante peroxidasa conjugado | Invitrogen | G21234 | Sección 7.2 Almacenamiento: Almacenar a -20 & grados; |
| C Peroxidasa Anticuerpo antiperoxidasa (PAP) producido en conejo para la detección de proteínas marcadas con TAP | Sigma Aldrich | P1291-500UL | Sección 7.2 Almacenamiento: Almacenar a -20 & grados; C |
| Anticuerpos IgG de conejo | Sigma | I5006-100MG | Sección 2 Almacenamiento: Almacenar a 4 & grados; C |
| Imprimaciones (10 y micro; M) | |||
| ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT | Sección 7.1 | ||
| K071 ADN plasmídico con espiga: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT | Sección 7.1 | ||
| PCR fuerte de ADN genómico de levadura como plantilla para amplificación ARS316 (para Southern blot): fwd 5'- AAATTCTGCCCTTGATTCGT rev 5'- TTTGTTTATCTCATCACTAAT | Sección 7.1 | ||
| PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT | Sección 7.1 | ||
| Equipment | |||
| café | Gastroback | 42601 | Section 4 |
| Matraz Dewar | NAL GENE | 4150-2000 | Sección 3 |
| Bastidor magnético DynaMag TM-2 | Invitrogen | 12321D | Sección 4, 5 y 6 |
| Horno de hibridación | Hybaid Mini10 | Ri418 | Sección 2 |
| Microcentrífuga | Eppendorf | 5424R | Sección 4 y 7.1 |
| Reticulante UV | Analytikjena | 95-0174-02 | Sección 7.1 |
Referencias
- Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome. Cell. 98 (3), 285-294 (1999).
- Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. Purification and enrichment of specific chromatin loci. Nature Methods
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Reimpresiones y permisos
