Identificación, diagnóstico y clasificación de tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos en modelos de ratón modificados genéticamente
Summary
Hemos desarrollado una metodología para evaluar si las neoplasias del sistema nervioso en ratones modificados genéticamente recapitulan con precisión la patología de sus homólogos humanos. Aquí, aplicamos estas técnicas histológicas, criterios patológicos definidos y metodologías de cultivo a neurofibromas y tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos que surgen en el modelo de ratón P 0-GGFβ3.
Abstract
Los pacientes con neurofibromatosis tipo 1 (NF1) del síndrome de susceptibilidad tumoral autosómica dominante suelen presentar neurofibromas plexiformes (NP) que posteriormente se transforman en tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos (MPNST) muy agresivos. La comprensión del proceso por el cual una NP se transforma en una MPNST se vería facilitada por la disponibilidad de modelos de ratón modificados genéticamente (GEM) que replican con precisión la progresión de la NP-MPNST observada en humanos con NF1. Desafortunadamente, los modelos GEM con ablación de Nf1 no recapitulan completamente este proceso. Esto nos llevó a desarrollar ratones P 0-GGFβ3, un modelo GEM en el que la sobreexpresión del mitógeno de la célula de Schwann neuregulina-1 (NRG1) en las células de Schwann da lugar al desarrollo de NPs que progresan hasta convertirse en MPNSTs con alta frecuencia. Sin embargo, para determinar si la tumorigénesis y la progresión neoplásica en ratones P 0-GGFβ3 modelan con precisión los procesos observados en pacientes con NF1, primero tuvimos que demostrar que la patología de los tumores de la vaina del nervio periférico P0-GGFβ3 recapitula la patología de sus homólogos humanos.
En este trabajo se describen las metodologías especializadas utilizadas para diagnosticar y clasificar con precisión las neoplasias del sistema nervioso periférico en modelos GEM, utilizando P 0-GGFβ3 y P0-GGFβ3; Trp53+/- ratones como ejemplo. Describimos los métodos histológicos, inmunohistoquímicos e histoquímicos utilizados para diagnosticar NP y MPNST, cómo distinguir estas neoplasias de otros tipos de tumores que imitan su patología y cómo clasificar estas neoplasias. Discutimos el establecimiento de cultivos de paso temprano a partir de MPNST GEM, cómo caracterizar estos cultivos mediante inmunocitoquímica y cómo verificar su tumorigénesis mediante el establecimiento de aloinjertos. En conjunto, estas técnicas caracterizan la patología de las NP y MPNST que surgen en los modelos GEM y comparan críticamente la patología de estos tumores murinos con sus homólogos humanos.
Introduction
Durante las últimas tres décadas, numerosos laboratorios han intentado crear modelos de ratón de cánceres humanos mediante la introducción de mutaciones asociadas al cáncer humano en el genoma del ratón o mediante la sobreexpresión de un producto génico que se sobreexpresa en los cánceres humanos. Los modelos de ratón modificados genéticamente (GEM) resultantes se pueden utilizar para una variedad de propósitos, como establecer que la modificación genómica recién introducida inicia la tumorigénesis, identificar otros cambios genéticos o epigenéticos que ocurren posteriormente y que contribuyen a la progresión tumoral y definir las vías de señalización clave que impulsan el inicio y la progresión del tumor. A diferencia de los modelos de xenoinjertos ortotópicos, que se basan en el uso de ratones inmunodeficientes, los modelos de cáncer GEM tienen un sistema inmunitario completamente funcional y, por lo tanto, modelan con mayor precisión las respuestas a los agentes terapéuticos candidatos. Sin embargo, cuando se utilizan modelos de cáncer GEM para fines como estos, es esencial que los investigadores confirmen que las observaciones realizadas con las neoplasias GEM son relevantes para sus contrapartes humanas. Esta validación debe incluir una evaluación exhaustiva de la patología de las neoplasias GEM y la determinación de si las características patológicas de las neoplasias GEM recapitulan la patología del tipo de tumor humano correspondiente.
El síndrome de susceptibilidad tumoral neurofibromatosis tipo 1 (NF1) es la enfermedad genética más común que afecta al sistema nervioso humano, ocurriendo en aproximadamente 1 de cada 3.000-3.500 nacidos vivos 1,2,3. Las personas afectadas por NF1 desarrollan múltiples tumores benignos de la vaina de los nervios periféricos conocidos como neurofibromas en la piel (neurofibromas dérmicos) y en los nervios grandes y plexos nerviosos (neurofibromas plexiformes). Mientras que tanto los neurofibromas dérmicos como los plexiformes empeoran la calidad de vida del paciente al producir deterioro físico, conductual y/o social, los neurofibromas plexiformes (NP) son particularmente peligrosos 4,5. Esto se debe a que las NP se transforman con frecuencia en tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos (MPNST), que son neoplasias agresivas de células fusiformes con una tasa de supervivencia excepcionalmente baja 1,2. En gran parte, esta baja tasa de supervivencia se debe a que los regímenes radioterapéuticos y quimioterapéuticos que se usan actualmente para tratar las MPNST son ineficaces. Sin embargo, el desarrollo de terapias nuevas y más efectivas ha sido un desafío. Esto se debe a que, a pesar de la frecuencia con la que se presentan las MPNST en pacientes con NF1, siguen siendo neoplasias raras. Como resultado, es muy difícil obtener un gran número de tumores humanos para su estudio; también es difícil reclutar suficientes pacientes con MPNST para ensayos clínicos. Para superar estas limitaciones, se han generado varios modelos GEM con el objetivo de obtener más información sobre las anomalías que impulsan la patogénesis del neurofibroma y la progresión de la NP-MPNST y facilitar los ensayos preclínicos con agentes terapéuticos candidatos.
Los pacientes con NF1 tienen mutaciones inactivadoras en una copia del gen NF1. La patogénesis del neurofibroma se desencadena cuando se produce una mutación inactivadora en el gen NF1 funcional restante en una célula del linaje celular de Schwann. Sorprendentemente, sin embargo, cuando los ratones fueron generados con mutaciones Nf1 inactivadoras de la línea germinal, no desarrollaron neurofibromas 6,7. La demostración posterior de que los ratones con células de Schwann nulas de Nf1 y haploinsuficiencia de Nf1 en todos los demás tipos de células (Krox20-Cre;Los neurofibromas plexiformes desarrollados por Nf1 flox/- desarrollaron neurofibromas sugirieron que se requería una dosis reducida del gen Nf1 en otros tipos celulares para la patogénesis del neurofibroma8. Incluso entonces, los neurofibromas plexiformes en Krox20-Cre; Los ratones Nf1 flox/- no progresaron hasta convertirse en MPNST y, por lo tanto, solo imitaron parcialmente la biología de sus contrapartes humanas. La patogénesis de MPNST se produjo cuando las mutaciones en Nf1 se asociaron con mutaciones en genes supresores de tumores adicionales, como Trp539 o Cdkn2a10, pero las MPNST en estos modelos GEM se desarrollaron de novo o a partir de neoplasias neurofibromatosas atípicas de potencial biológico incierto (ANNUBP)11,12, en lugar de a partir de neurofibromas plexiformes benignos preexistentes (ver13,14 para excelentes revisiones de estos modelos, así como de otros modelos que introducen mutaciones adicionales de pérdida de función asociadas a MPNST en genes como Suz12 y Pten15).
Estos modelos de ratón han sido muy valiosos para establecer el papel que desempeñan genes como NF1, TP53 y CDKN2A en la patogénesis de las neoplasias del sistema nervioso periférico asociadas a NF1 y para los ensayos preclínicos que prueban agentes terapéuticos candidatos. Sin embargo, todavía tenemos una comprensión incompleta del proceso por el cual los neurofibromas plexiformes progresan para convertirse en neoplasias neurofibromatosas atípicas de potencial biológico incierto (ANNUBPs16) y luego MPNST. Recientemente se han hecho algunos progresos en la comprensión de este proceso con el reciente informe de que los ratones con deleciones en Nf1 y Arf desarrollan ANNUBP que progresan hasta convertirse en MPNST11. Sin embargo, aún no existen modelos de ratón basados en mutaciones Nf1 que recapitulen completamente el proceso de progresión del neurofibroma plexiforme-MPNST observado en humanos. Además, no está claro si existen múltiples vías distintas que conducen al desarrollo de MPNST. Teniendo en cuenta esto, es posible que los GEM descritos anteriormente solo modelen un subconjunto de varias vías diferentes que conducen a la progresión del neurofibroma-MPNST y a la patogénesis de MPNST. Este punto se ve enfatizado por el hecho de que las MPNST también ocurren esporádicamente y que algunas MPNST esporádicas aparentemente no tienen mutaciones en NF1 17,18.
Aunque este último punto ha sido cuestionado por la reciente sugerencia de Magollon-Lorenz et al. de que al menos algunos MPNST esporádicos que carecen de mutaciones NF1 son melanomas o un tipo diferente de sarcoma19, recientemente hemos informado de un MPNST esporádico y una línea celular derivada de este tumor (células 2XSB) que era NF1 de tipo salvaje20. Durante la caracterización del tumor progenitor y de la línea celular 2XSB, descartamos sistemáticamente posibilidades diagnósticas alternativas, incluyendo el melanoma y los múltiples otros tipos de sarcoma que se consideran rutinariamente en el diagnóstico diferencial de un tumor maligno esporádico de la vaina del nervio periférico20. Además, observamos que Magollon-Lorenz et al. reconocieron que sus hallazgos en las tres líneas celulares esporádicas de MPNST que estudiaron no podían generalizarse para indicar que todos los tumores identificados como MPNST esporádicos no son MPNST.
Para construir un modelo GEM en el que el neurofibroma y la patogénesis de MPNST no dependieran necesariamente de mutaciones específicas de genes supresores de tumores, generamos ratones transgénicos en los que la sobreexpresión del potente mitógeno de la célula de Schwann, la neuregulina-1 (NRG1), fue impulsada por el promotor de la proteína de mielina cero (P0) específica de la célula de Schwann (ratones P 0-GGFβ3)21. Hemos demostrado previamente que los neurofibromas humanos, las MPNST y las líneas celulares MPNST expresan varias isoformas de NRG1 junto con las tirosina quinasas del receptor erbB (erbB2, erbB3 y erbB4) que median la señalización de NRG1 y que estos receptores erbB se activan constitutivamente22. También hemos demostrado que los inhibidores farmacológicos de las quinasas erbB inhiben potentemente la proliferación de MPNST22, la supervivencia23 y la migración24. De acuerdo con nuestras observaciones en humanos, los ratones P 0-GGFβ3 desarrollan neurofibromas plexiformes25 que progresan hasta convertirse en MPNST con una alta frecuencia21,25. Hemos demostrado que las MPNST P 0-GGFβ3, al igual que sus contrapartes humanas, comúnmente desarrollan mutaciones de Trp53 y Cdkn2a, así como muchas otras anomalías genómicas que potencialmente contribuyen a la tumorigénesis25. Las MPNST que surgen en ratones P 0-GGFβ3 no tienen mutaciones inactivadoras en Nf1. Sin embargo, utilizando la complementación genética, demostramos que NRG1 promueve la tumorigénesis en ratones P 0-GGFβ3 predominantemente a través de las mismas cascadas de señalización que se ven alteradas por la pérdida de Nf1 26; esta conclusión se basa en nuestro hallazgo de que la sustitución de la sobreexpresión de NRG1 por la pérdida de Nf1 en presencia de haploinsuficiencia de Trp53 (P 0-GGFβ3;Trp53+/- ratones) produce animales en los que las MPNST se desarrollan de novo, como se observa en cis-Nf1+/-; Ratones Trp53+/- 27.
Para obtener esta y otra información que demuestre que los ratones P 0-GGFβ3 modelan con precisión los procesos de patogénesis del neurofibroma y la progresión del neurofibroma-MPNST observados en humanos con NF1, hemos desarrollado metodologías especializadas para procesar tejidos de estos animales, diagnosticar con precisión sus tumores, clasificar los MPNST que surgen en estos ratones, establecer y caracterizar el paso temprano de P0-GGFβ3 y P0-GGFβ3; Trp53+/- cultivos de MPNST y comparación crítica de la patología de P 0-GGFβ3 NPs y MPNSTs y P0-GGFβ3; Trp53+/- MPNST a la de sus homólogos humanos. Muchas de estas metodologías son generalizables a otros modelos GEM de neoplasia del sistema nervioso. Además, varias de estas metodologías son aplicables de manera más amplia a los modelos GEM en los que las neoplasias surgen en otros sitios de órganos. En consecuencia, aquí presentamos una descripción detallada de estas metodologías.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos histológicos y bioquímicos presentados aquí proporcionan un marco para el diagnóstico y la caracterización de los modelos GEM de neurofibroma y patogénesis MPNST. A lo largo de los años, hemos encontrado que estas metodologías son de gran utilidad para evaluar la patología de los tumores de la vaina de los nervios periféricos que surgen en los modelos GEM 21,25,26. Sin embargo, si bien los protocolos descr…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por subvenciones del Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas y Accidentes Cerebrovasculares (R01 NS048353 y R01 NS109655 a S.L.C.; R01 NS109655-03S1 a D.P.J.), el Instituto Nacional del Cáncer (R01 CA122804 a S.L.C.) y el Departamento de Defensa (X81XWH-09-1-0086 y W81XWH-12-1-0164 a S.L.C.).
Materials
| 100 mm Tissue Culture Plates | Corning Falcon | 353003 | |
| 3, 3'- Diaminobensidine (DAB) | Vector Laboratories | SK-400 | |
| 6- well plates | Corning Costar | 3516 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse) | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse) | Invitrogen | A21043 or A11004 | |
| Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit) | Invitrogen | A11036 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Caldesmon | ABCAM | E89, ab32330 | |
| CD117 | Cell Marque | 117R-18-ASR | |
| CD163 | Leica | NCL-L-CD163 | |
| CD31 | ABCAM | ab29364 | |
| CD34 | ABCAM | ab81289 | |
| CD86 | ABCAM | ab53004 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.183 | |
| Cell Stripper | Corning | 25-056-CI | |
| Circle Coverslip | Fisher Scientific | 12-545-100 | |
| Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent) | Decon Laboratories | 5989-27-5 | |
| Critic Acid | Fisher Scientific | A104-500 | |
| Cytokeratin | ABCAM | C-11, ab7753 | |
| Desmin | Agilent Dako | clone D33 (M0760) | |
| Diaminobensizdine (DAB) Solution | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| Eosin Y | Thermo Scientific | 7111 | |
| Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Fetal Calf Serum | Omega Scientific | FB-01 | |
| Forksolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | |
| Harris Hematoxylin | Fisherbrand | 245-677 | |
| Hemacytometer | Brightline-Hauser Scientific | 1490 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | 327-500 | |
| Iba1 | Wako Chemicals | 019-19741 | |
| ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse | Vector Laboratories | MP-2400 | |
| ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit | Vector Laboratories | MP-7401 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i CO2 incubator | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A415 | |
| Ki-67 | Cell Signaling | 12202 | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| Liquid Nitrogen | |||
| MART1 | ABCAM | M2-9E3, ab187369 | |
| Microtome | |||
| Nestin | Millipore | Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401) | |
| Neuregulin 1 beta | In house | Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems) | |
| Neurofibromin | Santa Cruz Biotechnology | sc-67 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | Jackson Laboratory | 5557 | |
| Nonfat Dry Milk | Walmart | Great Value Brand | |
| P0-GGFβ3 mice | In house | ||
| Paraffin Wax | Leica | Paraplast 39601006 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | PM-999 | |
| Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J19943-K2 | |
| Permount (Xylene Mounting Medium) | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| pH Meter | Mettler Toldedo | Seven Excellence, 8603 | |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's) | Corning | 20-031-CV | |
| PMEL | ABCAM | EP4863(2), ab137078 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P5899-5MG | |
| Portable Isoflurance Machine | VetEquip Inhalation Anesthesia Systems | ||
| PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium) | Millipore Sigma | 10981100ML | |
| Rice Cooker | Beech Hamilton | ||
| S100B | Agilent Dako | Z0311 (now GA504) | |
| SMA | Ventana Medical Systems | clone 1A4 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640 | |
| Sodium Citrate (Dihydrate) | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| Sox10 | ABCAM | ab212843 | |
| Steel histology mold | |||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| TCF4/TCFL2 | Cell Signaling | (CH48H11) #2569 | |
| Tissue Cassette | |||
| Toluidine Blue | ACROS Organics | 348600050 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Trypsin | Corning | 25-051-31 |
Referencias
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