Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Efectos de Desmodium caudatum sobre las hormonas gastrointestinales y la flora intestinal en ratas con gastritis

2.1K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/65744

⸱

1 de marzo de 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory for Quality Control and Evaluation of Traditional Chinese Medicine of Mianyang City, Mianyang Normal University, 2The Traditional Chinese Medicine Hospital of Beichuan Qiang Autonomous County

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El presente protocolo describe el método para analizar la flora intestinal utilizando la secuenciación del gen 16S rRNA basado en Illumina y proporciona un marco para evaluar la eficacia de las decocciones herbales.

Resumen

Con el fin de explorar preliminarmente los efectos de Desmodium caudatum sobre la gastritis y la flora intestinal en ratas, se estableció un modelo de rata con gastritis crónica utilizando el método clásico de salicilato de sodio. Dieciocho ratas SPF se dividieron en tres grupos: el grupo de control (Grupo C), el grupo modelo (Grupo M) y el grupo de tratamiento (Grupo T). Se tomaron secciones patológicas de la pared gástrica de ratas de cada grupo. Además, las concentraciones de gastrina y malondialdehído en el suero de ratas de cada grupo se determinaron mediante ELISA. Además, se exploraron los efectos de D. caudatum en la flora intestinal de ratas con gastritis a través de una comparación detallada de las comunidades bacterianas intestinales en los tres grupos, empleando la secuenciación del gen 16S rRNA basado en Illumina. Los resultados indicaron que la decocción de D. caudatum podría reducir el contenido de malondialdehído y aumentar el contenido de gastrina. Además, se encontró que la decocción de D. caudatum mejora la diversidad y abundancia de la flora intestinal, ejerciendo un impacto positivo en el tratamiento de la gastritis al regular y restaurar la flora intestinal.

Introducción

La gastritis crónica (GC), una de las enfermedades clínicas más comunes, se caracteriza por cambios inflamatorios crónicos y persistentes en el epitelio de la mucosa gástrica, que es frecuente y repetidamente atacado por diversos factores patogénicos1. La tasa de incidencia de GC ocupa el primer lugar entre todos los tipos de enfermedades estomacales, representando entre el 40% y el 60% de la tasa de atención ambulatoria en el Servicio de Gastroenterología2. Además, la tasa de incidencia generalmente aumenta con la edad, especialmente en individuos de mediana edad y mayores3. Sin lugar a dudas, la GC reduce significativamente la calidad de vida de las personas, enfatizando la necesidad crítica de descubrir nuevos agentes terapéuticos.

Numerosos estudios han reportado que la aparición y el desarrollo de CG están relacionados con la secreción de hormonas gastrointestinales, como la gastrina (GAS)4,5. El GAS, una hormona peptídica gastrointestinal común en el tracto digestivo, estimula las células para que secreten ácido gástrico al promover la liberación de histamina de los eosinófilos. Además, mejora la nutrición y el riego sanguíneo de la mucosa gástrica, favoreciendo la proliferación de la mucosa gástrica y de las células parietales6. Por lo tanto, la gastrina se puede utilizar como un indicador para evaluar el nivel de desarrollo de CG. Además, los productos de peroxidación lipídica desencadenados por óxidos reactivos pueden activar las células inflamatorias, lo que conduce a la CG. El malondialdehído (MDA), un marcador de peroxidación lipídica, es un indicador comúnmente utilizado para medir el grado de estrés oxidativo. Refleja en cierta medida el nivel de radicales libres en la mucosa gástrica. El nivel de MDA puede indicar el ataque de ácidos grasos insaturados en la mucosa gástrica local causado por radicales libres 7,8.

La microecología intestinal consiste en millones de microorganismos que residen en el intestino del huésped, desempeñando un papel vital en el mantenimiento de la salud del huésped y la regulación de la inmunidad del huésped. Una flora intestinal sana, caracterizada por una alta riqueza, diversidad y una función microbiota estable, actúa como barrera protectora contra la invasión de microorganismos patógenos al participar en el metabolismo. Las alteraciones en la flora intestinal hacen que los individuos sean más susceptibles a las enfermedades gastrointestinales agudas y crónicas 9,10. En los últimos años, la terapia de la microbiota para las enfermedades gastrointestinales ha progresado rápidamente y ha demostrado una eficacia significativa11. En resumen, la consideración de la flora intestinal es crucial para comprender y abordar las enfermedades gastrointestinales.

Como componente indispensable del tesoro oculto de la medicina tradicional china, los materiales medicinales populares tienen una gran importancia para la práctica clínica y la modernización de la medicina nacional. Las raíces y las partes enteras de Desmodium caudatum (Thunb.) DC. se ha utilizado ampliamente para aliviar el malestar estomacal en el área de Beichuan Qiang de la ciudad de Mianyang durante un período prolongado. Algunos artículos indican la base científica para el tratamiento de las enfermedades gastrointestinales con D. caudatum, citando sus efectos como hemostasia, antioxidación y protección gastrointestinal 12,13,14. Sin embargo, debido a la falta de investigación en profundidad, no se ha establecido ningún mecanismo farmacodinámico clínico. Este artículo tiene como objetivo estudiar los efectos de D. caudatum en el tratamiento de la gastritis basada en hormonas gastrointestinales y flora intestinal, proporcionando una base para su aplicación clínica racional.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Los procedimientos para el cuidado y uso de los animales fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Normal de Mianyang, y se siguieron estrictamente todas las regulaciones institucionales y gubernamentales relevantes relacionadas con el uso ético de los animales. Para el presente estudio, se utilizaron ratas SPF (especies Kunming, tanto machos como hembras, con un peso de 180-220 g). Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). Todos los animales fueron alojados en un ambiente libre de patógenos y se les proporcionó acceso ad libitum a los alimentos.

1. Preparación de reactivos

  1. Prepare una solución de salicilato de sodio al 5% pesando 2,5 g de polvo de salicilato de sodio (ver Tabla de materiales) con una balanza electrónica. Disuelva el polvo en una pequeña cantidad de agua destilada y dilúyalo hasta un volumen total de 50 ml.
  2. Preparar la decocción de D. caudatum (12,8 g/kg). Pesar 128 g de D. caudatum (ver Tabla de Materiales), colocarlo en un matraz de fondo redondo que contenga 1000 mL de agua destilada de laboratorio y concentrarlo hasta un volumen final de 100 mL.

2. Agrupación y administración

  1. Divida las ratas en diferentes grupos y administre por vía intragástrica las soluciones requeridas.
    NOTA: Para el presente estudio, 18 ratas (9 machos, 9 hembras) fueron divididas en tres grupos: el grupo control (Grupo C), el grupo modelo (Grupo M) y el grupo tratamiento (Grupo T), con 6 ratas en cada grupo. El grupo control recibió solución salina y el grupo modelo recibió una solución de salicilato de sodio al 5% durante 5 semanas a una dosis de 10 mL/kg/día15. El grupo de tratamiento fue pretratado con una solución de salicilato de sodio al 5% durante 5 semanas a una dosis de 10 mL/kg/día, seguido de la administración de la decocción de D. caudatum a una dosis de 1 mL/100 g durante 10 días15,16.
  2. Recoja las heces de las ratas en tubos de microcentrífuga secos y estériles utilizando el método de transporte de cola17 el último día del experimento y congélelas en un congelador de nitrógeno líquido a temperatura ultrabaja.
  3. Una vez finalizado el muestreo, sacrificar las ratas por luxación cervical (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente). Abra la cavidad abdominal con unas tijeras para exponer la aorta abdominal.
    1. Inserte la aguja (23-25 G) casi paralela en la aorta abdominal, recoja el suero y consérvelo en un congelador de temperatura ultrabaja. Saque los estómagos de la cavidad abdominal16 y sumérjalos en una solución de formol al 10% para su conservación.
      NOTA: En el Grupo M, el modelo de gastritis crónica se considera exitoso si la mucosa gástrica está dilatada y congestionada con morfología glandular regular15, mientras se observa una pequeña cantidad de infiltración de células inflamatorias en la lámina propia.

3. Sección patológica de la pared gástrica

  1. Tome las muestras de la pared gástrica de las ratas de cada grupo para realizar secciones patológicas. Posteriormente, realizar tinción rutinaria de hematoxilina-eosina para observar y analizar los cambios patológicos18.

4. Determinación de hormonas gastrointestinales séricas

  1. En la muestra de suero, detecte el contenido de gastrina (GAS) y malondialdehído (MDA)19 utilizando ELISA siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales). Utilice un lector de microplacas para el análisis.

5. Extracción de ADN total fecal y amplificación y purificación por PCR

  1. Realice la extracción de ADN microbiano utilizando el kit de aislamiento de ADN disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales) y determine la concentración y la pureza utilizando el espectrofotómetro UV-Vis16. Posteriormente, evaluar la integridad del ADN mediante electroforesis en gel de agarosaal 1% 18.
  2. Amplifique el gen de ARNr 16S de las bacterias con los cebadores 338F (5′-ACT CCT ACG, GGA GGC AGC AG-3′) y 806R (5′-GAC, TAC, HVG, GGG, GTW, TCT AT-3′) utilizando un sistema de PCR termociclador17. Las imprimaciones se obtienen de fuentes comerciales (ver Tabla de Materiales).
    NOTA: Seguir el programa de PCR: desnaturalización (3 min, 95 °C), seguido de 27 ciclos (30 s, 95 °C; 30 s, 55 °C; 45 s, 72 °C) y una extensión final (10 min, 72 °C). Realizar reacciones de PCR con los siguientes componentes: 4 μL de tampón de ADN polimerasa 5×, 2 μL de dNTP de 2,5 mM, 0,8 μL de cada cebador (5 μM), 0,4 μL de ADN polimerasa y 10 ng de ADN molde (ver Tabla de materiales).
  3. Extraer, purificar y cuantificar los productos de PCR secuencialmente utilizando gel de agarosa al 2%, kit de extracción de gel de ADN disponible en el mercado y fluorómetro, respectivamente17.

6. Secuenciación

NOTA: Los pasos 6 y 7 se realizan siguiendo los métodos publicados anteriormente20,21.

  1. Utilice la plataforma Illumina para la secuenciación.
    NOTA: Un extremo del fragmento de ADN complementa la base del conector incrustado en el chip, asegurándolo al chip. El otro extremo complementa aleatoriamente la base de otra junta enterrada adyacente, formando un "puente".
  2. Realice la amplificación por PCR para generar grupos de ADN. Linealice los amplificadores de ADN en hebras simples.
  3. Introducir una ADN polimerasa alterada junto con trifosfatos de desoxirribonucleótidos (dNTP) con cuatro marcadores fluorescentes distintos. Sintetizar solo una base por ciclo.
  4. Utilice un láser para escanear la superficie de la placa de reacción y determinar los tipos de nucleótidos polimerizados durante la reacción inicial de cada secuencia de plantilla.
  5. Escinda químicamente el "grupo de fluorescencia" y el "grupo de terminación" para restablecer el extremo pegajoso de 3'. Posteriormente, se avanza a la polimerización del segundo nucleótido.
  6. Obtener la secuencia de fragmentos de ADN molde analizando los resultados de la señal de fluorescencia recogidos en cada ronda.

7. Tratamiento de los datos de secuenciación

  1. Inicialmente, recorte las lecturas de los datos fastq sin procesar en cualquier sitio con una puntuación < Q20 y elimine las lecturas con bases inciertas. Además, permite dos desajustes en imprimaciones que coincidan con precisión. Posteriormente, fusione las secuencias con una superposición >10 pb.
  2. Agrupar unidades taxonómicas operacionales (OTUs) con 97% de similitud utilizando UPARSE, y eliminar secuencias quiméricas con UCHIME20,21.
  3. Emplee el algoritmo RDP Classifier para analizar la taxonomía de cada secuencia del gen 16S rRNA con respecto a la base de datos de ARNr 16S Silva (SSU123), utilizando un umbral de confianza del 70%.
  4. Realice análisis de diversidad alfa y análisis de diversidad beta utilizando Mothur y Qiime, respectivamente (ver Tabla de materiales).

8. Análisis estadístico

  1. Analice los datos de este estudio utilizando un software de análisis estadístico (ver Tabla de Materiales). Emplee el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para las comparaciones entre varios grupos y utilice la prueba de la diferencia mínima significativa (LSD) para las comparaciones entre dos grupos.
  2. Considere que P < 0,05 es estadísticamente significativo en todas las comparaciones. P < 0,01 se considera extremadamente significativo.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Los resultados de la sección patológica de la pared del estómago se muestran en la Figura 1. En comparación con el grupo C, el grupo M presentó atrofia leve de la pared gástrica e inflamación leve. Sin embargo, en comparación con el grupo M, el grupo T no mostró inflamación, metaplasia intestinal o atrofia evidentes. Esto sugiere que la decocción de D. caudatum puede mejorar eficazmente la gastritis.

Los resultados de la prueba de hormonas gastrointestina...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

D. caudatum, una medicina popular comúnmente utilizada por la nacionalidad Qiang12, ha demostrado una eficacia significativa en el tratamiento de enfermedades gastrointestinales. Con el avance de la investigación farmacológica moderna, el desequilibrio de la flora resultante del desequilibrio de la microecología gastrointestinal se identifica como un factor clave en las enfermedades gastrointestinales agudas y crónicas22,23. Ciert...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por los proyectos clave de investigación y desarrollo del Departamento de Ciencia y Tecnología de la provincia de Sichuan (2020YFS0539).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Análisis de diversidad alfaMothur 1.30.2
AxyPrep kit de extracción en gel de ácido desoxirribonucleico (ADN) Axygen Biosciences AP-GX-50
Análisis de diversidad betaQiime 1.9.1
Refrigerador criogénicoForma-86C Ultracongelador
Desmodium caudatumHospital de Medicina Tradicional China de Beichuan, Condado Autónomo de Qiang
. kit de sueloOmega Bio-tekD5625-01
Illumina Plataforma MiSeqIllumina Miseq PE300/NovaSeq PE250
Multiskan SpectrumspectraMax i3
Agrupación en clústeres de OTUUparse 7.0.1090
Estadísticas de OTUUsearch 7.0
Instrumento de PCRTransGen AP221-02
Instrumento de PCRABI GeneAmp 9700
QuantiFluor-ST bicatenario Sistema de ADN (dsDNA)Promega Corp.
Anotación de clasificación de secuenciaRDP Clasificador 2.11
Salicilato de sodioSichuan Xilong Chemical Co., Ltd54-21-7
Ratas SPFChengdu Dashuo Experimental Animal Co., Ltd
SPSS 18.0IBM
, E.Z.N.A

Referencias

  1. Marginean, C. M., et al. The importance of accurate early diagnosis and eradication in Helicobacter pylori infection: pictorial summary review in children and adults. Antibiotics (Basel). 12 (1), 60(2022).
  2. Sipponen, P., Maaroos, H. I. Chronic gastritis. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 50 (6), 657-667 (2015).
  3. Wang, D. J. Methodological quality and reporting quality evaluation of chinese medicine diagnosis and treatment guidelines for chronic gastritis in China. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology. 24 (7), 2776-2783 (2022).
  4. Burkitt, M. D., Varro, A., Pritchard, D. M. Importance of gastrin in the pathogenesis and treatment of gastric tumors. World Journal of Gastroenterology. 15 (1), 1-16 (2009).
  5. Hayakawa, Y., Chang, W., Jin, G., Wang, T. C. Gastrin and upper GI cancers. Current Opinion in Pharmacology. 31, 31-37 (2016).
  6. Zhang, C. Z., He, M. X., Jin, L. W., Liu, W. D. Effect of aluminum phosphate gel combined with atropine on patients with acute gastritis and its effect on serum gastrin and malondialdehyde levels. International Journal of Digestive Diseases. 40 (2), 137-140 (2020).
  7. Wang, Y. K., et al. Levels of malondialdehyde in the gastric juice: its association with Helicobacter pylori infection and stomach diseases. Helicobacter. 23 (2), e12460(2018).
  8. Turkkan, E., et al. Does Helicobacter pylori-induced inflammation of gastric mucosa determine the severity of symptoms in functional dyspepsia. Journal of Gastroenterology. 44 (1), 66-70 (2009).
  9. Liu, Y., Cai, C., Qin, X. Regulation of gut microbiota of Astragali Radix in treating for chronic atrophic gastritis rats based on metabolomics coupled with 16S rRNA gene sequencing. Chemico-Biological Interactions. 365, 110063(2022).
  10. Gai, X., et al. Heptadecanoic acid and pentadecanoic acid crosstalk with fecal-derived gut microbiota are potential non-invasive biomarkers for chronic atrophic gastritis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 1064737(2023).
  11. Sgambato, D., et al. Gut microbiota and gastric disease. Minerva Gastroenterologica e Dietologica. 63 (4), 345-354 (2017).
  12. Li, J., et al. Pharmacogenetic study of Desmodium caudatum. Anais Da Academia Brasileira De Ciencias. 91 (2), e20180637(2019).
  13. Xu, Q. N., et al. Phenolic glycosides and flavonoids with antioxidant and anticancer activities from Desmodium caudatum. Natural Product Research. 35 (22), 4534-4541 (2021).
  14. Li, W., et al. Anti-inflammatory and antioxidant activities of phenolic compounds from Desmodium caudatum leaves and stems. Archives of Pharmacal Research. 37 (6), 721-727 (2014).
  15. Shao, X. H., Wang, J. G. Establishment of chronic atrophic gastritis in a rat model. Journal of Zhangjiakou Medical Collage. 19 (2), 11-13 (2002).
  16. Yu, C., et al. Dysbiosis of gut microbiota is associated with gastric carcinogenesis in rats. Biomedicine & Pharmacotherapy. 126, 110036(2020).
  17. Chen, R., et al. Fecal metabolomics combined with 16S rRNA gene sequencing to analyze the changes of gut microbiota in rats with kidney-yang deficiency syndrome and the intervention effect of You-gui pill. Journal of Ethnopharmacology. 224, 112139(2019).
  18. Li, Q., et al. Magnetic anchoring and guidance-assisted endoscopic irreversible electroporation for gastric mucosal ablation: a preclinical study in canine model. Surgical Endoscopy. 35 (10), 5665-5674 (2021).
  19. Xu, H., et al. Therapeutic assessment of fractions of Gastrodiae Rhizoma on chronic atrophic gastritis by 1H NMR-based metabolomics. Journal of Ethnopharmacology. 254, 112403(2020).
  20. Zhang, B. N., et al. Effects of Atractylodes lancea extracts on intestinal flora and serum metabolites in mice with intestinal dysbacteriosis. Proteome Science. 21 (1), 5(2023).
  21. Tian, H., et al. The therapeutic effects of Magnolia officinalis extraction on an antibiotics-induced intestinal dysbacteriosis in mice. Current Microbiology. 77 (9), 2413-2421 (2020).
  22. Wang, J., et al. Tumor and microecology committee of China anti-cancer association. Chinese expert consensus on intestinal microecology and management of digestive tract complications related to tumor treatment (version 2022). Journal of Cancer Research and Therapeutics. 18 (7), 1835-1844 (2022).
  23. Xu, W., Xu, L., Xu, C. Relationship between Helicobacter pylori infection and gastrointestinal microecology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 938608(2022).
  24. Johnson, J. S., et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Communications. 10 (1), 5029(2019).
  25. Callahan, B. J., et al. High-throughput amplicon sequencing of the full-length 16S rRNA gene with single-nucleotide resolution. Nucleic Acids Research. 47 (18), e103(2019).
  26. Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
  27. Huang, D., et al. Characteristics of intestinal flora in patients with gastric cancer based on high throughput sequencing technology. Chinese Journal of Clinical Research. 35 (3), 303-306 (2022).
  28. Shi, Y., Luo, J., Narbad, A., Chen, Q. Advances in lactobacillus restoration for β-lactam antibiotic-induced dysbiosis: a system review in intestinal microbiota and immune homeostasis. Microorganisms. 11 (1), 179(2023).
  29. Grigor'eva, I. N. Gallstone disease, obesity and the Firmicutes/Bacteroidetes ratio as a possible biomarker of gut dysbiosis. Journal of Personalized Medicine. 11 (1), 13(2020).
  30. Thorne, G. M. Diagnosis of infectious diarrheal diseases. Infectious Disease Clinics of North America. 2 (3), 747-748 (1988).
  31. Banks, M., et al. British society of gastroenterology guidelines on the diagnosis and management of patients at risk of gastric adenocarcinoma. Gut. 68 (9), 1545-1575 (2019).
  32. Roy-Lachapelle, A., et al. Evaluation of ELISA-based method for total anabaenopeptins determination and comparative analysis with on-line SPE-UHPLC-HRMS in freshwater cyanobacterial blooms. Talanta. 223, 121802(2021).
  33. Shahi, S. K., et al. Microbiota analysis using two-step PCR and next-generation 16S rRNA gene sequencing. Journal of Visualized Experiments. (152), e59980(2019).
  34. Huang, R., et al. Blocking-free ELISA using a gold nanoparticle layer coated commercial microwell plate. Sensors (Basel). 18 (10), 3537(2018).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Explorar más artículos

Gastritis crónicaniveles de gastrinacontenido de malondialdehídoensayo ELISAsecuenciación del ARNr 16Smicrobiota intestinalmodelo de rata
Efectos de Desmodium caudatum sobre las hormonas gastrointestinales y la flora intestinal en ratas con gastritis
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.