Modellierung der Multiplen Sklerose bei beiden Geschlechtern: MOG35-55-induzierte experimentelle Autoimmunenzephalomyelitis
Summary
Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis ist eines der am weitesten verbreiteten murinen Modelle der Multiplen Sklerose. Im aktuellen Protokoll werden C57BL/6J-Mäuse beiderlei Geschlechts mit dem Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteinpeptid immunisiert, was hauptsächlich zu einer aufsteigenden Parese des Schwanzes und der Gliedmaßen führt. Hier besprechen wir das Protokoll der EAE-Induktion und -Auswertung.
Abstract
Multiple Sklerose (MS) ist eine chronische, entzündliche Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS). Sie ist gekennzeichnet durch eine unterschiedliche Prävalenz in den Geschlechtern, von denen mehr Frauen als Männer betroffen sind, und durch unterschiedliche Verläufe, die bei Männern aggressivere Formen aufweisen als bei Frauen. Darüber hinaus ist MS sehr heterogen in Bezug auf klinische Aspekte, radiologische und pathologische Merkmale. Daher ist es notwendig, experimentelle Tiermodelle zu nutzen, die es ermöglichen, so viele Aspekte der Pathologie wie möglich zu untersuchen. Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) stellt eines der am häufigsten verwendeten MS-Modelle bei Mäusen dar und modelliert verschiedene Krankheitsmerkmale, von der Aktivierung des Immunsystems bis hin zu ZNS-Schäden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induktion von EAE in männlichen und weiblichen C57BL/6J-Mäusen unter Verwendung der Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein-Peptid-35-55-Immunisierung (MOG35-55), die zur Entwicklung einer chronischen Form der Krankheit führt. Wir berichten auch über die Auswertung des täglichen klinischen Scores und der motorischen Leistung dieser Mäuse für 28 Tage nach der Immunisierung (28 dpi). Abschließend erläutern wir einige grundlegende histologische Analysen auf ZNS-Ebene, wobei wir uns auf das Rückenmark als primären Ort der krankheitsbedingten Schädigung konzentrieren.
Introduction
Multiple Sklerose (MS) ist eine chronische, entzündliche Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS). Es zeigt das Vorhandensein einer perivaskulären Infiltration von Entzündungszellen, Demyelinisierung, axonalen Verlust und Gliose1. Die Ätiologie ist nach wie vor unbekannt, und ihre klinischen Aspekte, Röntgen- und pathologischen Merkmale deuten auf eine bemerkenswerte Heterogenität der Erkrankung hin2.
Aufgrund der unbekannten Ätiologie und Komplexität gibt es derzeit kein Tiermodell, das alle klinischen und radiologischen Merkmale der humanen MS rekapituliert 3,4. Es werden jedoch verschiedene Tiermodelle verwendet, um verschiedene Aspekte von MS 3,4 zu untersuchen. In diesen Modellen ist die Initiierung der Krankheit in der Regel extrem künstlich, und der Zeitrahmen für das Auftreten klinischer Symptome ist zwischen Menschen und Mäusen unterschiedlich. Beim Menschen beispielsweise bleiben die pathophysiologischen Prozesse, die der Krankheit zugrunde liegen, jahrelang unentdeckt, bevor klinische Manifestationen auftreten. Umgekehrt können die Experimentatoren Symptome im Tiermodell innerhalb von Wochen oder sogar Tagen nach der MS-Induktion feststellen4.
Drei grundlegende Tiermodelle zeigen die für MS charakteristischen Merkmale der Demyelinisierung: virusinduzierte (z. B. Theiler-murine Enzephalomyelitis-Virus), solche, die durch toxische Wirkstoffe induziert werden (z. B. Cuprizon, Lysolecithin) und die verschiedenen Varianten der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE)5. Jedes Modell hilft bei der Untersuchung einiger spezifischer Facetten der Krankheit, aber keines repliziert alle Merkmale von MS6. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, das richtige Modell unter Berücksichtigung der spezifischen experimentellen Anforderungen und der zu beantwortenden wissenschaftlichen Fragen auszuwählen.
Dank Immunisierungsverfahren gegen Myelin-abgeleitete Antigene wird EAE durch das Auslösen einer Autoimmunantwort auf ZNS-Komponenten in anfälligen Mäusen induziert. Das Zusammenspiel zwischen einer Vielzahl von immunpathologischen und neuropathologischen Mechanismen führt bei den immunisierten Mäusen zur Entwicklung der wichtigsten pathologischen Merkmale der MS (d. h. Entzündung, Demyelinisierung, axonaler Verlust und Gliose) 7,8. Mäuse zeigen etwa in der zweiten Woche nach der Impfung klinische Symptome und zeigen in der Regel eine aufsteigende Lähmung vom Schwanz bis zu den Gliedmaßen und Vordergliedmaßen. Der klinische Score (d.h. die Quantifizierung der Anhäufung krankheitsbedingter Defizite) wird in der Regel anhand einer 5-Punkte-Skala7 bewertet.
Eine aktive Immunisierung mit Protein oder Peptid oder ein passiver Transfer von enzephalitogenen T-Zellen kann verwendet werden, um EAE bei Mäusen mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund (z. B. SJL/J, C57BL/6 und nicht-adipös-diabetische (NOD) Mäuse) zu induzieren. Das Myelin-Proteolipidprotein (PLP), das Myelin-Basisprotein (MBP) und das Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) sind Beispiele für Selbst-ZNS-Proteine, aus denen normalerweise Immunogene hergestellt werden. Insbesondere SJL/J-Mäuse, die mit dem immundominanten Epitop von PLP (PLP139−151) immunisiert wurden, entwickeln einen schubförmig-remittierenden (RR) Krankheitsverlauf, während C57BL/6J-Mäuse, die mit dem immundominanten MOG35-55-Peptid immunisiert wurden, EAE chronischer Natur zeigen1. Trotz einiger Einschränkungen, wie z.B. sehr wenig Informationen über das Fortschreiten der MS, die Rolle der B-Zellen in der Krankheit, die Inside-Out-Mechanismen oder Schwierigkeiten bei der Untersuchung der Remyelinisierung, haben die EAE-Modelle enorm zum Verständnis von Autoimmun- und neuroinflammatorischen Prozessen beigetragen, das Wissen auf dem Gebiet der MS erweitert und so die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze für diese Krankheit ermöglicht4. 6. Anmelden
In der vorliegenden Arbeit konzentrierten wir uns auf eine bestimmte Form von aktivem EAE, das Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteinpeptid 35-55 (MOG35-55)-induzierte Form 9,10,11,12. Die MOG35-55-induzierte EAE modelliert eine chronische Form der MS. Nach der Immunisierung durchlaufen die Mäuse innerhalb der ersten Woche nach der Immunisierung eine asymptomatische Phase, dann tritt die Krankheit typischerweise in der zweiten Woche nach der Immunisierung auf, während die Krankheit zwischen der dritten und vierten Woche nach der Immunisierung chronisch wird, ohne dass eine vollständige Genesung von den angesammelten Defiziten möglichist 7,8,13. Interessanterweise werden in den meisten der in der Literatur vorhandenen Studien keine Unterschiede zwischen Männern und Frauen in Bezug auf Inzidenz, Krankheitsbeginn, -verlauf oder -progression beobachtet14, auch wenn weniger Studien die Krankheit bei Männern und Frauen vergleichen.
Im Gegensatz dazu sind diese Parameter beim Menschen als stark sexuell dimorphbekannt 2. MS betrifft mehr Frauen als Männer; Männer entwickeln jedoch in der Regel eine aggressivere Form der Krankheit2. Diese Beweise deuten auf eine wesentliche und komplexe Rolle der Gonadenhormone hin15; Dennoch sind die Rolle und der Wirkmechanismus von Sexualhormonen in der Pathologie noch unklar. Darüber hinaus unterstützen Daten aus Tiermodellen die Idee, dass sowohl Östrogene als auch Androgene auf geschlechtsspezifische Weise positive Auswirkungen auf verschiedene Bereiche der Pathologie ausüben16,17.
Einige Studien deuten auch auf neuroprotektive, promyelinisierende und entzündungshemmende Wirkungen von Progesteronhin 18 , und obwohl die Evidenz bei MS-Patienten spärlich ist18, könnten neuroaktive Steroide (d. h. de novo synthetisierte Steroide des Nervensystems, wie Pregnenolon, Tetrahydroprogesteron und Dihydroprogesteron) auch den pathologischen Verlauf beeinflussen19. Zusammengenommen unterstützen diese Daten die Idee, dass Sexualhormone, die sowohl peripher als auch im ZNS produziert werden, eine wichtige und geschlechtsspezifische Rolle beim Ausbruch und Fortschreiten der Krankheit spielen. Daher drängen wir in der vorliegenden Arbeit darauf, getrennte Daten sowohl von männlichen als auch von weiblichen Tieren zu sammeln.
Aus histopathologischer Sicht dient die weiße Substanz des Rückenmarks als Hauptlokalisation der ZNS-Schädigung in diesem Modell, das durch multifokale, konfluente Regionen mononukleärer entzündlicher Infiltration und Demyelinisierung gekennzeichnet ist8. Bei der Beschreibung dieses Protokolls zur Induktion von MOG35-55-induzierter EAE in C57BL/6J-Mäusen werden wir daher den Krankheitsverlauf bei beiden Geschlechtern berücksichtigen und einige histopathologische Einblicke in das Rückenmark geben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das von uns beschriebene MOG35-55-induzierte EAE-Protokoll führte zur Entwicklung einer chronischen Form der MS in C57BL/6J-Mäusen 7,8,13. In diesen repräsentativen Ergebnissen berichteten wir, dass die Tiere beiderlei Geschlechts, die sich der Immunisierung unterzogen hatten, eine chronische Form der Krankheit entwickelten (d.h. sie erholen sich nach Ausbruch der Krankheit nicht vollständig, sie akkumulieren Defi…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt vom Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca – MIUR-Projekt Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 und 2023-2027 an die Abteilung für Neurowissenschaften Rita Levi Montalcini; Cavalieri-Ottolenghi-Stiftung, Orbassano, Italien. BB war Fellow von INFRA-P, Region Piemont (n.378-35) (2022-2023) und PRIN 2020 – 20203AMKTW. Wir danken der Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus (FORB) für die Unterstützung. Die Publikationsgebühren wurden durch die freundliche Spende von Distretto Rotaract 2031 und insbesondere des Rotaract Club Torino Nord-Est unterstützt. Wir danken Elaine Miller für das Korrekturlesen unseres Manuskripts.
Materials
| 18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe | Terumo | TER-HYP-18G-112-PIN | |
| Digital camera connected to the optical microscope | NIKON DS-U1 digital camera | ||
| Electronic precision balance | Merck | Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | HT110216 | |
| Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml | Sacco System | L003465 | |
| Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion) | VWR | 213-1170, 213-1172 | |
| Hematoxylin (Mayer’s) | Sigma-Aldrich | MHS32 | Filter before using it. |
| Image analysis Software | Fiji | ||
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C. |
| Isoflurane | Wellona Pharma | This drug is used as inhalational anaesthetic. | |
| Male and female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory, Envigo | Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g. | |
| Microtome | Leica HistoCore BIOCUT R | ||
| Mounting Medium | Merck | 107961 | |
| Mouse Rotarod | Ugo Basile | #47600 | |
| Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra | Difco Laboratories Inc. | 231141 | Store at +4 °C. |
| Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) | Espikem | EPK1 | Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations. |
| Optical microscope | NIKON eclipse 90i | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer. |
| Pertussis toxin (PT) | Duotech | PT.181 | Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution |
| Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution) | B. Eurospital | A 032182038 | Store at +4 °C once opened. |
| Saline phosphate buffer (PBS) | Thermo Scientific | J61196.AP | |
| Software for image acquisition | NIS-Element AR 2.10 | ||
| Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle | Nipro | SYMS-0.5U100-3008B-EC | |
| Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle | PIC | 20,71,26,03,00,354 | |
| Vet ointment for eyes | Lacrilube, Lacrigel Europhta | ||
| Xylazine | Rompun | This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative. | |
| Zolazepam and Tiletamine | Zoletil 100 | This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic |
Referencias
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