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Artículo de método

Alteración de la barrera hematoencefálica del ratón por pequeñas vesículas extracelulares de placentas humanas hipóxicas

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DOI:

10.3791/65867

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26 de enero de 2024

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1Vascular Physiology Laboratory, Department of Basic Sciences, Universidad del Bío-Bío, Chillan, 2Nursery School, Health Faculty, Universidad Santo Tomás, Los Angeles, 3Obstetrics and Gynecology Department, Herminda Martin Clinical Hospital, Chillan, 4Faculty of Medicine, Universidad Católica de la Santísima Concepción, Concepcion, 5Laboratory of Animal Biotechnology, Department of Animal Science, Faculty of Veterinary Sciences, Universidad de Concepción, Chillan, 6Group of Research and Innovation in Vascular Health (GRIVAS Health), Chillan

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Se presenta un protocolo para evaluar si los pequeños VE (sEV) aislados de explantes placentarios cultivados en condiciones hipóxicas (modelando un aspecto de la preeclampsia) alteran la barrera hematoencefálica en ratones hembra adultos no preñados.

Resumen

Las complicaciones cerebrovasculares, como el edema cerebral y el accidente cerebrovascular isquémico y hemorrágico, constituyen la principal causa de mortalidad materna asociada a la preeclampsia. Los mecanismos subyacentes de estas complicaciones cerebrovasculares siguen sin estar claros. Sin embargo, están relacionados con la disfunción placentaria y la alteración de la barrera hematoencefálica (BBB). Sin embargo, la conexión entre estos dos órganos distantes aún se está determinando. Cada vez hay más pruebas que sugieren que la placenta libera moléculas de señalización, incluidas vesículas extracelulares, en la circulación materna. Las vesículas extracelulares se clasifican según su tamaño, siendo las pequeñas vesículas extracelulares (sEVs de menos de 200 nm de diámetro) consideradas partículas críticas de señalización tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. En la preeclampsia, hay un mayor número de EV circulantes en la circulación materna, cuya función de señalización no se comprende bien. Las EV placentarias liberadas en la preeclampsia o de placentas normales del embarazo expuestas a hipoxia inducen disfunción endotelial cerebral y alteración de la BHE. En este protocolo, evaluamos si los sEV aislados de explantes placentarios cultivados en condiciones hipóxicas (modelando un aspecto de la preeclampsia) alteran la BHE in vivo.

Introducción

Aproximadamente 70% de las muertes maternas debidas a preeclampsia, un síndrome de embarazo hipertensivo caracterizado por alteración de los procesos de placentación, disfunción endotelial sistémica materna y, en casos graves, falla multiorgánica 1,2, se asocian con complicaciones cerebrovasculares agudas 3,4. La mayoría de las muertes maternas ocurren en países de ingresos bajos y medianos5. Sin embargo, los mecanismos subyacentes aún no están claros a pesar de la relevancia clínica y epidemiológica de las complicaciones cerebrovasculares asociadas con la preeclampsia.

Por otro lado, las vesículas extracelulares (VE) (diámetro ~30-400 nm) son mediadores esenciales de la comunicación intercelular entre tejidos y órganos, incluyendo la interacción madre-placenta6. Además de las proteínas y los lípidos de la superficie externa, los VE transportan carga en su interior (proteínas, ARN y lípidos). Los VE se pueden clasificar en (1) exosomas (diámetro ~50-150 nm, también llamados VE pequeños (sEV)), (2) EV medianos/grandes y (3) cuerpos apoptóticos, que difieren por tamaño, biogénesis, contenido y función de señalización potencial. La composición de las VE está determinada por las células de las que proceden y por el tipo de enfermedad7. Las VE derivadas de sincitiotrofoblastos expresan fosfatasa alcalina placentaria (PLAP)8,9, que detecta pequeñas VE circulantes derivadas de placenta (PDsEV) en el embarazo. Además, el PLAP ayuda a discernir los cambios en la carga de PDsEVs y sus efectos en la preeclampsia versus embarazos normotensos 10,11,12,13,14,15.

La placenta ha sido reconocida como el componente necesario en la fisiopatología de la preeclampsia16 o complicaciones cerebrales asociadas a esta enfermedad 17,18,19. Sin embargo, se desconoce cómo este órgano distante podría inducir alteraciones en la circulación cerebral. Dado que los sEV desempeñan un papel fundamental en la comunicación de célula a célula debido a su capacidad para transferir componentes bioactivos de las células donantes a las receptoras 6,20,21, un número creciente de estudios han asociado los sEV placentarios con la generación de disfunción endotelial materna 21,22,23,24, incluidas las células endoteliales cerebrales 25,26en mujeres con preeclampsia. Por lo tanto, el compromiso de la función endotelial cerebral puede conducir a la alteración de la barrera hematoencefálica (BHE), un componente crítico en las complicaciones cerebrovasculares asociadas a la preeclampsia 3,27.

Sin embargo, los hallazgos preclínicos utilizando vasos cerebrales de rata expuestos al suero de mujeres con preeclampsia28 o células endoteliales cerebrales humanas expuestas al plasma de mujeres con preeclampsia29 informaron que los factores circulantes inducen la alteración de la BHE. A pesar de que existen varios candidatos con potencial para dañar la BHE presente en la circulación materna durante la preeclampsia, como niveles elevados de citocinas proinflamatorias (i.e., factor de necrosis tumoral)18,28 o reguladores vasculares (i.e., factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF))29,30,31, o moléculas oxidativas como las lipoproteínas oxidadas (oxo-LDL)32,33, entre otros34, ninguno de ellos establece una conexión directa entre la placenta y la BHE. Recientemente, los sEV aislados de placentas hipóxicas han demostrado la capacidad de alterar la barrera hematoencefálica en ratones hembra no preñados25. Dado que los SEV placentarios pueden transportar la mayoría de los factores circulantes enumerados con la capacidad de alterar la BHE, los SEV se consideran candidatos adecuados para conectar la placenta lesionada, ser portadores de factores circulantes dañinos y alterar la BHE en la preeclampsia.

Este protocolo nos permite investigar si los sEV aislados de explantes placentarios cultivados en condiciones hipóxicas pueden alterar la BHE en ratones hembra no preñados como un proxy para comprender la fisiopatología de las complicaciones cerebrales durante la preeclampsia.

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Protocolo

La investigación se realizó siguiendo los principios expresados en la Declaración de Helsinki y bajo la autorización de los respectivos Comités de Revisión Ética. Todos los participantes humanos dieron su consentimiento informado antes de la recolección de la muestra, como se informó anteriormente25. Adicionalmente, el Comité de Bioética y Bioseguridad de la Universidad del Bío-Bío aprobó este proyecto (beca Fondecyt 1200250). El trabajo con animales se llevó a cabo de acuerdo con los principios cardinales de las tres R en el uso de animales en experimentación35, y de acuerdo con las recomendaciones de las guías para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicadas por el Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos. Los animales fueron mantenidos en ambientes apropiados en el Vivarium de la Universidad del Bío-Bío. Las placentas frescas (n = 4) se obtuvieron dentro de 1 h después de la cesárea electiva de madres (28-31 años) con embarazos normales a término (38 a 41 semanas de gestación). Las cesáreas se realizaron en el Hospital Clínico Herminda Martín, Chillán, Chile, como se informó previamente25. Para aplicar el modelo in vivo se utilizaron ratones hembra no preñada de 4-6 meses de edad (cepa C57BLACK/6). Se dividieron en tres grupos experimentales: (1) control (sin tratamiento), (2) tratados con sEVs de normoxia (sEVs-Nor), y (3) tratados con sEVs de placentas hipóxicas cultivadas (sEVs-Hyp), que se utilizaron para evaluar la disrupción de la BHE in vivo25. Todas las soluciones inyectadas fueron estériles. Además, la preparación de los vehículos eléctricos se realizó en condiciones asépticas y bajo una campana de bioseguridad clase II para evitar la contaminación.

1. Explantes de cultivo placentario

  1. Para extraer explantes de placentas normales del embarazo, consulte el método publicado por Miller et al. 200536.
  2. Retire con cuidado los coágulos de la placa basal de la placenta humana con pinzas esterilizadas. Extraer pequeños explantes para obtener una extracción final de tejido de 10 g.
  3. Asegúrese de que los explantes placentarios se eliminen de los cuatro cuadrantes de la porción materna de la placenta. Asegúrese de que se excluyan los tejidos desvitalizados y las áreas calcificadas.
  4. Para manipular el tejido placentario, hágalo en hielo, en condiciones estériles y dentro de un gabinete de bioseguridad.
  5. Lavar los explantes (al menos tres veces) con grandes cantidades (cinco volúmenes de los explantes) de solución tampón fosfatada fría (4 °C) (PBS 1x, pH 7,4) para eliminar la mayor cantidad de sangre posible. Centrifugar (252 x g durante 10 min) a temperatura ambiente entre lavados.
  6. Resuspender 10 g de explantes lavados en 20 mL de medio de cultivo suplementado con suero fetal bovino al 2%, 100 UI/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina (ver Tabla de Materiales).
  7. Coloque la suspensión en una placa de cultivo de 100 mm. Dejar los explantes durante 2 h en una incubadora a 37 °C con 21% de oxígeno y 5% de CO2.
  8. Después de eso, vuelva a lavar los explantes con 1x PBS a 37 °C (tres veces). Centrifugar (252 x g durante 10 min) a temperatura ambiente entre lavados.
  9. Además, resuspender el tejido en 20 mL de medio de cultivo previamente agotado de nanopartículas.
    NOTA: Para el agotamiento de nanopartículas, realice ultracentrifugación (120.000 x g durante 18 h a temperatura ambiente) y microfiltración (filtro de 0,22 μm).
  10. Dividir los explantes resuspendidos en dos placas de cultivo (100 mm). Cada placa de cultivo debe incluir 10 mL de explantes resuspendidos.
  11. A continuación, colocar una de las placas que contienen explantes placentarios en condiciones de cultivo estándar (37 °C con 8% de oxígeno y 5% de CO2), mientras se coloca la otra en una cámara hipóxica con 1% deO2.
    NOTA: (OPCIONAL) El análisis de la viabilidad tisular se puede realizar utilizando las mismas extracciones tisulares y el ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (ensayo MTT) como se describe en otra parte37,38. Utilice la concentración total de proteína medida en los homogeneizados de explantes para normalizar los valores de MTT.
  12. Después de 18 h en cultivo, cosechar los medios acondicionados de los explantes en un nuevo tubo de 15 mL.
    NOTA: En este paso, los medios acondicionados se pueden congelar (-80 °C) durante un período prolongado (semanas).

2. Aislamiento de sEVs derivados de la placenta

  1. Aislar los sEV del medio acondicionado utilizando el protocolo de centrifugación diferencial y microfiltración siguiendo los informes publicados anteriormente25,39.
  2. Realice la centrifugación secuencial para el medio acondicionado cosechado. Los pasos secuenciales de las centrifugaciones son (1) 300 x g durante 10 min, (2) 2000 x g durante 10 min, (3) 10.000 x g durante 30 min y (4) 120.000 x g durante 2 h. Realice las centrifugaciones a temperatura ambiente.
  3. En todas estas centrifugaciones, utilizando una pipeta de 20-100 μL, recoja cuidadosamente el sobrenadante y deseche el gránulo.
  4. Una vez hecho esto, pase el último sobrenadante recolectado a través de un filtro de 0,22 μm (ver Tabla de Materiales). Posteriormente, realice una centrifugación adicional a 120.000 x g durante 18 h a temperatura ambiente.
  5. A continuación, deseche el sobrenadante mientras se resuspende el gránulo (que contiene sEV placentarios) en 500 μL de PBS (pH 7,4) y vuelva a pasar por un filtro de 0,22 μm. Por último, realizar una última centrifugación a 120.000 x g durante 3 h a temperatura ambiente.
  6. A continuación, vuelva a suspender el gránulo (que contiene sEV placentarios) en 500 μL de PBS (pH 7,4, previamente agotado de sEV) y pase a través de un filtro de 0,22 μm.
  7. Etiquete las muestras como stock de sEVs-Normoxia (sEVs-Nor) o sEVs-Hypoxia (sEVs-Hyp).
    NOTA: Prepare 50-100 μL de alícuotas de los sEV aislados para su posterior experimentación. Los vehículos eléctricos pequeños pueden almacenarse a -80 °C durante un período prolongado (meses).
  8. Caracterizar los sEVs placentarios por tamaño, recuento y marcador proteico de los sEVs, como se informó anteriormente25. El diámetro medio ideal de las partículas de los sEV es de 50-150 nm.
    NOTA: La caracterización de los sEVs incluye la detección positiva de CD63, Tsg101, Alix y HSP70 (es decir, para caracterizar la población de sEVs enriquecidos en exosomas). Además, utilice PLAP como marcador de origen placentario25.
  9. Mida la cantidad total de proteína en la solución de sEV utilizando el kit de ensayo de proteína BCA siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: La Figura 1 muestra una descripción general del cultivo de explantes placentarios y el aislamiento de vesículas extracelulares.

3. Inyección de ratones

  1. Anestesiar al animal en una cámara de inducción anestésica con una distribución de isoflurano al 5% (ver Tabla de Materiales). Verifique el nivel de anestesia con un pellizco en el dedo del pie.
  2. Después de ~ 40 s, coloque el ratón en el sistema de anestesia usando una máscara facial y mantenga un nivel de anestesia de isoflurano al 2%.
  3. A continuación, coloque al animal en una plataforma calefactora (véase la tabla de materiales) a una temperatura ambiente de 28 °C. Mantén los ojos lubricados con lágrimas artificiales.
  4. Antes de inyectar, diluir los sEV placentarios (200 μg de proteína total) con tampón fosfato (pH, 7,4) hasta alcanzar un volumen final de 70 μL.
  5. Desinfecte el área de inyección con etanol al 70% e hisopos de algodón. Asegúrese de usar una jeringa de insulina con una aguja de 30 G para inyectar la solución de sEV.
    NOTA: La jeringa se puede colocar en la plataforma de calentamiento durante 5 minutos para adquirir una temperatura fisiológica.
  6. Luego, inyecte la solución en la vena yugular externa. Este paso necesita un entrenamiento especial.
    NOTA: El procedimiento debe realizarse con precaución, retrayendo lentamente la aguja y aspirando suavemente hasta evidenciar reflujo sanguíneo.
  7. Después de la inyección, aplique una ligera presión en el área inyectada durante ~ 15 s con un hisopo de algodón seco. Después de eso, regrese a los animales a sus respectivas jaulas.
  8. Asegúrese de evaluar la conciencia y el comportamiento durante 15 minutos. Un indicador del logro de la conciencia es la recuperación animal de la actividad motora total.
    NOTA: Asegúrese de mantener una temperatura cálida en las jaulas de los animales.

4. Escala rápida de coma murino y comportamiento (RMCBS)

  1. Utilizar el RMCBS para evaluar los parámetros neurológicos y de bienestar de los animales40.
    NOTA: RMCBS permite una evaluación rápida (~ 3 min) con un estrés mínimo del animal debido a la intervención del operador. RMCBS tiene diez parámetros (cada puntuación es de 0 a 2).
  2. Evalúe el bienestar del ratón con la escala RMCBS a las 0 h (antes de inyectar sEV) y a las 3 h, 6 h, 12 h y 24 h después de la inyección.
    NOTA: Realizar análisis de claudina-5 (a las 6 h después de la inyección de sEVs) y la extravasación azul de Evan (a las 24 h después de la inyección de sEVs) para evaluar la disrupción de la BHE (Figura 2).

5. Análisis de la extravasación azul de Evan

  1. Después de la inyección de sEVs placentarios (24 h), anestesiar a los ratones como se describe en el paso 3.1.
  2. Prepare la solución azul de Evan (2%, diluida en solución tampón de fosfato, 1x) (consulte la tabla de materiales).
  3. Utilizando el acceso retroorbital25, inyectar la solución de Evan's Blue a 2 mL/kg.
  4. Deje que la solución azul de Evan circule durante 20 minutos bajo el mantenimiento de la anestesia.
  5. A continuación, realice la perfusión intracardíaca siguiendo el protocolo41 descrito anteriormente con solución salina (~3 ml, 0,9%, p/v) para eliminar el colorante azul de Evan de la circulación. Este paso es obligatorio.
    NOTA: Para este procedimiento, aumente la anestesia al 5% y verifique un plano profundo de anestesia (es decir, una reducción drástica de la frecuencia respiratoria).
  6. Exponer el corazón mediante toracotomía medial41 (Figura 3).
  7. Después de eso, fije todo el animal con una infusión intracardíaca de solución de paraformaldehído (4% en PBS, v/v).
    NOTA: Compruebe la rigidez de la cola para controlar la fijación adecuada.
  8. Además, una vez completada la fijación, extrae cuidadosamente el cerebro, pésalo y fotografíalo41. Tome fotografías con todo el cerebro cerca de una regla42.
  9. A continuación, coloque el cerebro en una cortadora de ratón de cerebro (consulte la Tabla de materiales).
  10. Diseccionar el cerebro en nueve secciones, grulla-caudal, incluyendo el cerebelo (100 μm cada sección).
  11. Después de la disección, visualice y capture imágenes de los cortes de cerebro en un microscopio con zoom estereoscópico (ver Tabla de materiales).
  12. Utilice las imágenes capturadas para cuantificar la extravasación azul de Evan utilizando el software ImageJ (consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: Para analizar la presencia del colorante azul de Evan, establezca los valores de azul de Evan utilizando un control positivo de la sección del cerebro (de un animal control inyectado con tinte pero sin perfusión intracárdica). Los valores de azul de Evan alcanzados por el control positivo están generalmente entre 75 y 110 en el histograma de intensidad del canal azul (Figura 4).
  13. Asegúrese de que las imágenes cerebrales sean analizadas a ciegas por el grupo experimental respectivo para evitar el sesgo del observador. Alternativamente, cuantifique la extravasación azul de Evan mediante homogeneización cerebral seguida de espectroscopía43.
    NOTA: En experimentos separados, utilizando cerebros recién aislados de ratones inyectados en sEVs (6 h), analice los niveles de proteína de claudina 5 (CLND-5) (ver Tabla de Materiales), una unión estrecha crítica involucrada en la estrechez de la BBB44 (Figura 5).

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Resultados

Este protocolo evalúa la capacidad de los sEVs derivados de placentas cultivadas en hipoxia para alterar la BHE en ratones no preñados. Este método permite comprender mejor la posible conexión entre la placenta y el cerebro en condiciones normales y patológicas. En particular, este método puede constituir un proxy para analizar la participación de los sEV placentarios en la aparición de complicaciones cerebrales en la preeclampsia.

A diferencia de los ratones inyectados con sEVs-Nor, los raton...

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Discusión

Este estudio revela nuevos conocimientos sobre el daño potencial resultante de los sEV aislados de explantes placentarios cultivados en condiciones hipóxicas en la alteración de la barrera hematoencefálica de roedores. El mecanismo patológico implica una reducción de la CLND-5 en la región posterior del cerebro25.

Investigaciones previas han revelado que los plasma-sEVs de individuos con preeclampsia inducen disfunción endotelial en diversos órganos utilizando modelos <...

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Divulgaciones

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que declarar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a los investigadores pertenecientes a GRIVAS Health su valiosa aportación. Asimismo, las parteras y el personal clínico del Servicio de Obstetricia y Ginecología pertenecen al Hospital de Chillán, Chile. Fundada por Fondecyt Regular 1200250.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ratón adulto cerebro slecer matrice matriz, impreso en 3Darchivo de acceso abiertoratones adultos, ratón adulto, rebanador de cerebro. Impreso en filamento PLA.
Anticuerpo primario anti β-actinaSigma-AldrichClon AC-74Anticuerpo para el control de la carga (Western blot)
Anticuerpo primario anti-Claudin5Santa cruz Biotechnologysc-374221Anticuerpo primario para la proteína de unión estrecha CLDN5 de ratones BBB (Western blot)
Kit de proteínas BCAThermo Scientific23225Kit para medir la concentración de proteínas
Medios de cultivo #200 500 mLThermo Fisher Scientificm200500Medios de cultivo para explantes placentarios
D180 Incubadora de CO2RWD CienciasD180Incubadora estándar para estabilizar explantes y cultivos sEVs-Nor
Evans tinte azul > 75% 10 gSigma-AldrichE2129.10GColorante para analizar la disrupción de la barrera hematoencefálica IN VIVO
Suero fetal bovino 500 mLThermo Fisher Scientific16000044Factor de crecimiento aditivo para medios de cultivo 200
Ultracentrífuga Himac CP100NXHimac Eppendorf group5720410101Ultracentrífuga para medios acondicionados > 1,20,000 x g
Software ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isoflurano x 100 mLUSP Baxter212-094Anestésico inhalado volátil para ratones
Kit CellTiter 96 No radiactivo Promega0000105232Ensayo in vitro para la viabilidad de explantes placentarios
IgG de ratón Anticuerpo secundario ThermoFisher ScientificMO 63103Anticuerpo secundario para CLDN5 (Western blot)
NanoSight NS300Malvern Panalytical90278090Análisis de nanotracking de partículas de explantes placentarios con medios condicionados
Paraformaldehide E 97% solución 500 mLThermo Fisher ScientificA11313.22Solución fijadora para cortes de tejido cerebral y perfusión intracardíaca (una vez diluida)
PBS 1 x pH 7,4 500 mLThermo Fisher Scientific10010023Solución de lavado para explantes de placenta
Penicilina-estreptomicina 100x 20 mLThermo Fisher Scientific10378016Antiobióticos para medios
de cultivo de explantes placentariosProOX C21 Controlador de subcámara O2 y CO2BioSpherixSCR_021131Regulador de CO2 para inducir hipoxia en cámara sellada para sEVs-Hyp
Tiopental sódico 1 gChemie7061agente de eutanasia humanitaria
Sistema de anestesia de bajo flujo SomnosuiteScientificsSS-01Vaporizador de isoflurano para pequeños roedores
Plataforma de calentamiento quirúrgicoKent ScientificsA41166Plataforma de calentamiento para la anestesia de mantenimiento en ratones
Filtros de jeringa, politetrafluoroetileno (PTFE), hidrófobo, 0,22 y micro; m, Estéril, 25 mmMaterial de laboratorio del sur10026Filtración de medios condicionados recolectados de explantes de placenta 
Microcentrífugas de mesa de alta velocidad  HITACHI himac CT15E/CT15RESistemas médicos de Hitachi6020Centrifugaciones en serie de medios acondicionados < 1,20, 000 x g
Microscopio estereoscópico trinocular transmidado y luz reflectante 10x-160x Center Medical2597Microscopio estereoscópico para registrar cortes de cerebro
, , de la vida Kent

Referencias

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