Alteración de la barrera hematoencefálica del ratón por pequeñas vesículas extracelulares de placentas humanas hipóxicas

Resumen

Se presenta un protocolo para evaluar si los pequeños VE (sEV) aislados de explantes placentarios cultivados en condiciones hipóxicas (modelando un aspecto de la preeclampsia) alteran la barrera hematoencefálica en ratones hembra adultos no preñados.

Resumen

Las complicaciones cerebrovasculares, como el edema cerebral y el accidente cerebrovascular isquémico y hemorrágico, constituyen la principal causa de mortalidad materna asociada a la preeclampsia. Los mecanismos subyacentes de estas complicaciones cerebrovasculares siguen sin estar claros. Sin embargo, están relacionados con la disfunción placentaria y la alteración de la barrera hematoencefálica (BBB). Sin embargo, la conexión entre estos dos órganos distantes aún se está determinando. Cada vez hay más pruebas que sugieren que la placenta libera moléculas de señalización, incluidas vesículas extracelulares, en la circulación materna. Las vesículas extracelulares se clasifican según su tamaño, siendo las pequeñas vesículas extracelulares (sEVs de menos de 200 nm de diámetro) consideradas partículas críticas de señalización tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. En la preeclampsia, hay un mayor número de EV circulantes en la circulación materna, cuya función de señalización no se comprende bien. Las EV placentarias liberadas en la preeclampsia o de placentas normales del embarazo expuestas a hipoxia inducen disfunción endotelial cerebral y alteración de la BHE. En este protocolo, evaluamos si los sEV aislados de explantes placentarios cultivados en condiciones hipóxicas (modelando un aspecto de la preeclampsia) alteran la BHE in vivo.

Introducción

Aproximadamente 70% de las muertes maternas debidas a preeclampsia, un síndrome de embarazo hipertensivo caracterizado por alteración de los procesos de placentación, disfunción endotelial sistémica materna y, en casos graves, falla multiorgánica ^1,2, se asocian con complicaciones cerebrovasculares agudas ^3,4. La mayoría de las muertes maternas ocurren en países de ingresos bajos y medianos⁵. Sin embargo, los mecanismos subyacentes aún no están claros a pesar de la relevancia clínica y epidemiológica de las complicaciones cerebr....

Protocolo

La investigación se realizó siguiendo los principios expresados en la Declaración de Helsinki y bajo la autorización de los respectivos Comités de Revisión Ética. Todos los participantes humanos dieron su consentimiento informado antes de la recolección de la muestra, como se informó anteriormente²⁵. Adicionalmente, el Comité de Bioética y Bioseguridad de la Universidad del Bío-Bío aprobó este proyecto (beca Fondecyt 1200250). El trabajo con animales se llevó a cabo de acuerdo con los principios cardinales de las tres R en el uso de animales en experimentación³⁵, y de acuerdo con las recomendaciones de las guías para el ....

Resultados

Este protocolo evalúa la capacidad de los sEVs derivados de placentas cultivadas en hipoxia para alterar la BHE en ratones no preñados. Este método permite comprender mejor la posible conexión entre la placenta y el cerebro en condiciones normales y patológicas. En particular, este método puede constituir un proxy para analizar la participación de los sEV placentarios en la aparición de complicaciones cerebrales en la preeclampsia.

A diferencia de los ratones inyectados con sEVs-Nor, los raton.......

Discusión

Este estudio revela nuevos conocimientos sobre el daño potencial resultante de los sEV aislados de explantes placentarios cultivados en condiciones hipóxicas en la alteración de la barrera hematoencefálica de roedores. El mecanismo patológico implica una reducción de la CLND-5 en la región posterior del cerebro²⁵.

Investigaciones previas han revelado que los plasma-sEVs de individuos con preeclampsia inducen disfunción endotelial en diversos órganos utilizando modelos <.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ratón adulto cerebro slecer matrice matriz, impreso en 3D	archivo de acceso abierto	ratones adultos	, ratón adulto, rebanador de cerebro. Impreso en filamento PLA.
Anticuerpo primario anti β-actina	Sigma-Aldrich	Clon AC-74	Anticuerpo para el control de la carga (Western blot)
Anticuerpo primario anti-Claudin5	Santa cruz Biotechnology	sc-374221	Anticuerpo primario para la proteína de unión estrecha CLDN5 de ratones BBB (Western blot)
Kit de proteínas BCA	Thermo Scientific	23225	Kit para medir la concentración de proteínas
Medios de cultivo #200 500 mL	Thermo Fisher Scientific	m200500	Medios de cultivo para explantes placentarios
D180 Incubadora de CO2	RWD Ciencias	D180	Incubadora estándar para estabilizar explantes y cultivos sEVs-Nor
Evans tinte azul > 75% 10 g	Sigma-Aldrich	E2129.10G	Colorante para analizar la disrupción de la barrera hematoencefálica IN VIVO
Suero fetal bovino 500 mL	Thermo Fisher Scientific	16000044	Factor de crecimiento aditivo para medios de cultivo 200
Ultracentrífuga Himac CP100NX	Himac Eppendorf group	5720410101	Ultracentrífuga para medios acondicionados > 1,20,000 x g
Software ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isoflurano x 100 mL	USP Baxter	212-094	Anestésico inhalado volátil para ratones
Kit CellTiter 96 No radiactivo	Promega		0000105232Ensayo in vitro para la viabilidad de explantes placentarios
IgG de ratón Anticuerpo secundario Thermo	Fisher Scientific	MO 63103	Anticuerpo secundario para CLDN5 (Western blot)
NanoSight NS300	Malvern Panalytical	90278090	Análisis de nanotracking de partículas de explantes placentarios con medios condicionados
Paraformaldehide E 97% solución 500 mL	Thermo Fisher Scientific	A11313.22	Solución fijadora para cortes de tejido cerebral y perfusión intracardíaca (una vez diluida)
PBS 1 x pH 7,4 500 mL	Thermo Fisher Scientific	10010023	Solución de lavado para explantes de placenta
Penicilina-estreptomicina 100x 20 mL	Thermo Fisher Scientific	10378016	Antiobióticos para medios
de cultivo de explantes placentariosProOX C21 Controlador de subcámara O2 y CO2	BioSpherix	SCR_021131	Regulador de CO2 para inducir hipoxia en cámara sellada para sEVs-Hyp
Tiopental sódico 1 g	Chemie	7061	agente de eutanasia humanitaria
Sistema de anestesia de bajo flujo Somnosuite	Scientifics	SS-01	Vaporizador de isoflurano para pequeños roedores
Plataforma de calentamiento quirúrgico	Kent Scientifics	A41166	Plataforma de calentamiento para la anestesia de mantenimiento en ratones
Filtros de jeringa, politetrafluoroetileno (PTFE), hidrófobo, 0,22 y micro; m, Estéril, 25 mm	Material de laboratorio del sur	10026	Filtración de medios condicionados recolectados de explantes de placenta
Microcentrífugas de mesa de alta velocidad  HITACHI himac CT15E/CT15RE	Sistemas médicos de Hitachi	6020	Centrifugaciones en serie de medios acondicionados < 1,20, 000 x g
Microscopio estereoscópico trinocular transmidado y luz reflectante 10x-160x	Center Medical	2597	Microscopio estereoscópico para registrar cortes de cerebro

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