提出了一种方案来评估从缺氧条件下培养的胎盘外植体中分离出的小 EV (sEV)(模拟先兆子痫的一个方面)是否会破坏未怀孕成年雌性小鼠的血脑屏障。
脑血管并发症,包括脑水肿、缺血性和出血性卒中,是先兆子痫导致孕产妇死亡的主要原因。这些脑血管并发症的潜在机制尚不清楚。然而,它们与胎盘功能障碍和血脑屏障 (BBB) 破坏有关。然而,这两个遥远器官之间的联系仍在确定中。越来越多的证据表明,胎盘将信号分子(包括细胞外囊泡)释放到母体循环中。细胞外囊泡根据其大小进行分类,小细胞外囊泡(直径小于 200 nm 的 sEV)在生理和病理条件下都被认为是关键信号转导颗粒。在先兆子痫中,母体循环中循环的sEV数量增加,其信号传导功能尚不清楚。在先兆子痫或暴露于缺氧的正常妊娠胎盘中释放的胎盘 sEV 会诱导脑内皮功能障碍和 BBB 破坏。在该方案中,我们评估了从缺氧条件下培养的胎盘外植体中分离的sEV(模拟先兆子痫的一个方面)是否会破坏 体内的BBB。
大约70%的孕产妇死于先兆子痫,这是一种高血压妊娠综合征,其特征是胎盘过程受损,母亲全身性内皮功能障碍,严重时出现多器官衰竭1,2,与急性脑血管并发症有关3,4。大多数孕产妇死亡发生在低收入和中等收入国家5.然而,尽管与先兆子痫相关的脑血管并发症具有临床和流行病学相关性,但其潜在机制仍不清楚。
另一方面,细胞外囊泡 (EV)(直径 ~30-400 nm)是组织和器官之间细胞间通讯的重要介质,包括母胎相互作用6。除了外表面的蛋白质和脂质外,电动汽车还携带货物(蛋白质、RNA 和脂质)。EV 可分为 (1) 外泌体(直径 ~50-150 nm,也称为小型 EV (sEV))、(2) 中型/大型 EV 和 (3) 凋亡体,其大小、生物发生、含量和潜在的信号传导功能不同。EV 的组成由它们起源的细胞和疾病类型 7 决定。合体滋养层衍生的 EV 表达胎盘碱性磷酸酶 (PLAP)8,9,可检测妊娠期胎盘衍生的循环小 EV (PDsEV)。此外,PLAP 有助于辨别 PDsEV 货物的变化及其对子痫前期与血压正常妊娠的影响 10、11、12、13、14、15。
胎盘已被公认为先兆子痫病理生理学的必要组成部分16 或与该疾病相关的脑并发症 17,18,19。然而,这个远处的器官如何诱导脑循环的改变尚不清楚。由于 sEV 能够将生物活性成分从供体转移到受体细胞 6,20,21,因此越来越多的研究将胎盘 sEV 与母体内皮功能障碍的产生联系起来 21,22,23,24,包括脑内皮细胞25,26在患有先兆子痫的女性中。因此,脑内皮功能的损害可能导致血脑屏障 (BBB) 的破坏,血脑屏障是与子痫前期相关的脑血管并发症的关键组成部分 3,27。
然而,使用暴露于子痫前期女性血清的大鼠脑血管28 或暴露于子痫前期女性血浆的人脑内皮细胞29 的临床前研究结果报告说,循环因子诱导 BBB 的破坏。尽管有几种候选药物有可能损害先兆子痫期间母体循环中存在的血脑屏障,例如促炎细胞因子(即肿瘤坏死因子)18,28 或血管调节剂(即血管内皮生长因子 (VEGF))29,30,31 或氧化分子(如氧化脂蛋白 (oxo-LDL)32,33 等)水平升高34,它们都没有在胎盘和血脑屏障之间建立直接联系。最近,从缺氧胎盘中分离出的 sEV 显示出破坏未怀孕雌性小鼠 BBB 的能力25。由于胎盘 sEV 可能携带大多数列出的循环因子,具有破坏 BBB 的能力,因此 sEV 被认为是连接受损胎盘、成为有害循环因子的载体并破坏先兆子痫的 BBB 的合适候选者。
该协议使我们能够研究从在缺氧条件下培养的胎盘外植体中分离的sEV是否可以破坏未怀孕雌性小鼠的BBB,作为了解先兆子痫期间脑并发症的病理生理学的代表。
这项研究揭示了从缺氧条件下培养的胎盘外植体中分离出的 sEV 对啮齿动物血脑屏障破坏的潜在危害的新见解。病理机制涉及后脑区25中CLND-5的减少。
先前的研究表明,使用体外模型46,47,来自先兆子痫患者的血浆 sEV 会诱导各种器官的内皮功能障碍。这项研究特别仔细检查了血脑屏障,为从缺氧培养的胎盘?…
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢 GRIVAS Health 的研究人员的宝贵意见。此外,妇产科的助产士和临床工作人员属于智利奇兰医院。由 Fondecyt Regular 1200250 创立。
Adult mice brain slecer matrice 3D printed | Open access file | Adult mice | Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament. |
Anti β-Actin primary antibody | Sigma-Aldrich | Clon AC-74 | Antibody for loading control (Western blot) |
Anti-Claudin5 primary antibody | Santa cruz Biotechnology | sc-374221 | Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot) |
BCA protein kit | Thermo Scientific | 23225 | Kit for measuring protein concentration |
Culture media #200 500 mL | Thermo Fisher Scientific | m200500 | Culture media for placental explants |
D180 CO2 incubator | RWD Life science | D180 | Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor |
Evans blue dye > 75% 10 g | Sigma-Aldrich | E2129.10G | Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO |
Fetal bovine serum 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Additive growth factor for culture media 200 |
Himac Ultracentrifuge CP100NX | Himac eppendorf group | 5720410101 | Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g |
ImageJ software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
Isoflurane x 100 mL | USP Baxter | 212-094 | Volatile inhalated anaesthesia agent for mice |
Kit CellTiter 96 Non-radioactive | Promega | 0000105232 | In vitro assay for placental explants viability |
Mouse IgG Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | MO 63103 | Secondary antibody for CLDN5 (western blot) |
NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | 90278090 | Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media |
Paraformaldehide E 97% solution 500 mL | Thermo Fisher Scientific | A11313.22 | Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted) |
PBS 1 X pH 7.4 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Wash solution for placenta explants |
Peniciline-streptomicine 100x 20 mL | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | Antiobiotics for placental explants culture media |
ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller | BioSpherix | SCR_021131 | CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp |
Sodium Thiopental 1 g | Chemie | 7061 | humanitarian euthanasia agent |
Somnosuite low flow anesthesia system | Kent Scientifics | SS-01 | Isoflurane vaporizer for small rodents |
Surgical Warming platform | Kent Scientifics | A41166 | Warming platform for mainteinance anesthesia in mice |
Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm | Southern labware | 10026 | Filtration of condicioned media harvested from placental explants |
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE | Hitachi medical systems | 6020 | Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g |
Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x | Center Medical | 2597 | Stereomicroscope to register brain slices |