Summary
Burada, sulu eksikliği olan kuru göz çalışmasına bir temel sağlamak için bir sıçan lakrimal bez disfonksiyonu modeli oluşturuyoruz.
Abstract
Sulu eksik kuru göz (ADDE), gözyaşı salgısı miktarının ve kalitesinin azalmasına neden olabilen bir tür kuru göz hastalığıdır. Uzun süreli anormal gözyaşı üretimi, kornea hasarı ve iltihaplanma dahil olmak üzere oküler yüzey ortamında bir rahatsızlığa yol açabilir. Ağır vakalarda, ADDE görme kaybına ve hatta körlüğe neden olabilir. Şu anda, kuru göz tedavisi, yalnızca göz rahatsızlığı semptomlarını hafifletebilen ve kuru göz sendromunu temel olarak tedavi edemeyen göz damlası veya fizik tedavi ile sınırlıdır. Kuru gözde gözyaşı bezinin işlevini eski haline getirmek için, skopolamin tarafından indüklenen sıçanlarda gözyaşı bezi disfonksiyonunun bir hayvan modelini oluşturduk. Gözyaşı bezi, kornealar, konjonktivalar ve diğer faktörlerin kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesi yoluyla, ADDE'nin patolojik değişikliklerinin tam olarak anlaşılmasını sağlamayı amaçlıyoruz. Mevcut kuru göz faresi modeliyle karşılaştırıldığında, bu ADDE hayvan modeli, gözyaşı bezinin işlevsel bir değerlendirmesini içerir ve ADDE'de gözyaşı bezi disfonksiyonunu incelemek için daha iyi bir platform sağlar.
Introduction
2021 yılına kadar, insanların yaklaşık %12'si kuru gözlerden önemli ölçüde etkileniyor1 ve bu da onu en yaygın kronik göz hastalıklarından biri haline getiriyor. Göz kuruluğu, hastalığı etkileyen farklı faktörlere bağlı olarak iki türe ayrılabilir: sulu eksik kuru göz (ADDE) ve evaporatif kuru göz (EDE)2. ADDE ayrıca Sjögren sendromu (SS) ve SS dışı olarak ikiye ayrılır, ancak klinik3'te kuru göz hastalarının çoğunluğu SS olmayan hastalardır. Kronik kuru göz belirtileri hastaların görme kalitesini ciddi şekilde etkiler. Şu anda, DED'in geleneksel tedavisi, oküler yüzeyi yağlamak için suni gözyaşı uygulamasını ve göz kapaklarının fizik tedavisini içermektedir. Bununla birlikte, kuru göz sendromu birçok durumda tam bir tedavi sunmayabilir. Bu nedenle, kuru göz hastalığının patogenezini araştırmak, yeni tedavilerin ve ilaçların geliştirilmesi için çok önemlidir. Kuru göz sendromunun hayvan modelleri, daha fazla araştırma için bir temel sağlar.
Hormon seviyelerini değiştirerek gözyaşı salgı seviyelerini değiştirmek de dahil olmak üzere, kuru göz sendromu4'ün hayvan modellerini oluşturmanın birçok yolu vardır. Örneğin, sıçanların testislerinin çıkarılması androjen sekresyonunu azaltabilir, gözyaşı sekresyonunu artırabilir ve gözyaşlarında serbest salgı bileşeni (SC) ve IgA konsantrasyonunu azaltabilir 5,6. Diğer bir yöntem ise bezi kontrol eden göz yüzeyi sinirlerinin çıkarılarak gözyaşı bezindeki otoimmün reaksiyonların gösterilmesidir. Ek olarak, gözyaşı bezinin cerrahi olarak çıkarılmasıyla gözyaşı salgısının doğrudan azaltılması sağlanabilir7. Değişen çevresel koşullar da gözyaşı buharlaşmasını hızlandırabilir. Örneğin, hayvanların düşük nem ve kuru havalandırma koşullarında kültürlenmesi, kuru gözün şiddetini artırmak için diğer yöntemlerle birleştirilebilen bir aşırı buharlaşmalı kuru göz8 modeli oluşturabilir. Kuru göz deneysel modellerini indüklemek için kullanılan ana ilaçlar atropin ve skopolamin9'dur. Parasempatik inhibitörler olarak, her ikisi de gözyaşı bezindeki kolinerjik (muskarinik) reseptörlerin farmakolojik blokajını indükleyebilir ve gözyaşı sekresyonunu inhibe edebilir. Atropin kas enjeksiyonunun10 neden olduğu kuru gözlerle karşılaştırıldığında, skopolamin salgı bezleri üzerinde daha güçlü bir inhibitör etkiye, daha uzun bir ilaç etkisi süresine ve kardiyak, ince bağırsak ve bronşiyal düz kaslar üzerinde daha zayıf etkilere sahiptir. Kuru göz hayvan modelleri için en olgun ilaçlardan biridir.
Skopolamin ile kuru gözü indüklemek için deri altı enjeksiyon, ilaç pompası veya yama uygulaması gibi farklı yöntemler kullanılabilir 4,11,12. Deney hayvanlarına ilaç uygulama sıklığını azaltmak için, birçok araştırmacı farelerin kuyruklarına transdermal yamalar uygular veya ilaç pompaları kullanır. Ancak, bu yöntemlerin her ikisinin de sınırlamaları vardır. Örneğin, transdermal yamaların emiliminin, tutarsız ilaç dozajına yol açabilecek farelerin bireysel emilimini hesaba katması gerekir. İlaç pompaları her uygulamanın dozajını doğru bir şekilde kontrol edebilse de, verilen ilaçla veya kullanılan konsantrasyonla her zaman uyumlu değildir. Ayrıca cerrahi olarak yerleştirilmeleri gerekir - bu hayvan için daha invazivdir, anestezik bir olay gerektirir ve ayrışma gibi cerrahi sonrası komplikasyonlar için potansiyel vardır. Deri altı enjeksiyon, daha hantal olmasına rağmen, her uygulama için doğru dozajı sağlayabilir ve farklı sıçanlar arasında ilaç uygulamasında tutarlılığı koruyabilir. Aynı zamanda, daha düşük bir maliyete sahiptir ve çok sayıda hayvan deneyi yapmak için uygundur.
Bu çalışma, kuru göz sıçan modeli oluşturmak için tekrarlanan subkutan skopolamin enjeksiyonunu uygulamaktadır. Kornea defektleri, gözyaşı salgı seviyeleri ve kornea, konjonktiva ve gözyaşı bezinin patolojik morfolojisi gibi kuru göz göstergelerini analiz ediyoruz. İlaç konsantrasyonunu, patolojik belirtileri ve kuru göz semptomlarını birleştirerek, kuru göz sıçan modelini ayrıntılı olarak detaylandırıyoruz ve kuru göz tedavisi ve patolojik mekanizmaların incelenmesi için daha doğru deneysel veriler sağlıyoruz. Ayrıca gelecekteki araştırmacılar için modelleme sürecini ayrıntılı olarak açıklıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokole uygun olarak yapılan tüm hayvan deneyleri, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) onayı altında gerçekleştirilmektedir.
1. Hayvan hazırlama
- 160 g ± 20 g ağırlığında 12 sağlıklı 6 haftalık SPF Wistar dişi sıçan hazırlayın.
- Tüm sıçanların göz koşullarını incelemek için bir yarık lamba ve oftalmoskop kullanın, ön segment veya retina hastalığı olmadığından emin olun.
- Tüm fareleri 1 hafta boyunca yeterli yiyecek ve su kaynakları ile büyütün.
- Tüm sıçanlar rastgele normal, skopolamin ilaç konsantrasyonu 2.5 mg / mL, skopolamin ilaç konsantrasyonu 5 mg / mL ve skopolamin ilaç konsantrasyonu 7.5 mg / mL gruplarına ayrıldı ve her grupta üç hayvan vardı.
2. Çözelti hazırlama
- 7.5 mg/mL, 5 mg/mL ve 2.5 mg/mL konsantrasyonlarında bir çözelti yapmak için skopolamin hidrobromürü %0.9 sodyum klorür çözeltisi içinde çözerek hazırlayın.
- Sıçanların kontrol grubu için enjeksiyon olarak kullanılmak üzere skopolamin hidrobromür içermeyen% 0.9'luk bir sodyum klorür çözeltisi hazırlayın.
3. Ekipman ve malzeme hazırlama
- Küçük bir hayvan mikroskobu hazırlayın.
- İğneli 1 mL tek kullanımlık şırınga (26 G) dahil olmak üzere deney için malzemeler hazırlayın; floresein sodyum oftalmik şeritler; Schirmer yırtılma test şeridi; mutlak etanol; % 4 paraformaldehit; Ksilen; nötr balsam; hematoksilen, eozin; ve periyodik asit-Schiff boyama kiti.
4. Deri altı enjeksiyon
NOT: Bu prosedür, farelerin güvenliğini sağlamaya yardımcı olmak için ikinci bir kişiden yardım gerektirir.
- Sıçanın vücudunu sabit tutun ve sol (veya sağ) arka ayaklarını yakalayın ve gerin.
NOT: Bir asistan hayvanı tutmaya yardımcı olabilir. - Enjeksiyon bölgesini alkolle temizleyin.
- İğneli 1 mL tek kullanımlık şırıngayı (26 G) başparmak ve parmak arasındaki cilt kıvrımının tabanına yerleştirin.
- Şırınga pistonunu geri çekerek şırıngayı aspire edin. Şırıngadaki herhangi bir kan, iğnenin yanlış yerleştirildiğini gösterir; İğneyi çıkarın ve yeniden konumlandırın.
- Sabit, akıcı bir hareketle skopolamin hidrobromürlü veya skopolamin hidrobromür olmadan% 0.9 sodyum klorür çözeltisi uygulayın.
- Tüm sıçanlara farklı konsantrasyonlara göre, her seferinde 0.5 mL ve günde dört kez (9:00, 12:00, 15:00 ve 18:00'de) art arda 19 günlük bir süre boyunca, sol ve sağ ekstremiteler arasında dönüşümlü olarak enjekte edin.
NOT: Gruplar aşağıdaki gibi adlandırılır:
Skopolamin hidrobromür içermeyen grup: 0 grup (kontrol)
Skopolamin hidrobromürlü grup 2.5 mg/mL: 2.5 grup
Skopolamin hidrobromürlü grup 5 mg/mL: 5 grup
Skopolamin hidrobromürlü grup 7.5 mg/mL: 7.5 grup - Hayvanı kafesine geri koyun ve 5-10 dakika boyunca solunum ve davranışlarını izleyin.
5. Gözyaşı sekresyon testi (Schirmer gözyaşı testi, STT)
- Sıçanlar için değiştirilmiş bir filtre kağıdı şeridi oluşturun11. İnsanlar için kullanılan filtre kağıdı şeridinin yarısını merkez çizgisi boyunca (1 mm × 15 mm) kesin ve pürüzsüz hale getirmek için şeridin başını kesin.
NOT: Gözyaşı salgı testini yapmadan önce, hareketi önlemek ve sıçanın gözlerinin açıkta kalmasını sağlamak için sıçanın vücudunu manuel olarak kısıtlayın. - Filtre kağıdı şeridini sıçanın alt göz kapağı konjonktival kesesinin dış 1 / 3'üne yerleştirin.
- Testi 5 dakika boyunca zamanlayın. İşlem boyunca sıçanın gözlerinin kapanmasını kontrol edin.
- Ölçümden sonra, filtre kağıdı şeridini bir mikrosantrifüj tüpüne sıkıştırmak için cımbız kullanın ve tüpün duvarında bir işaret yaparak yırtılma hacmini kaydedin.
- Gözyaşı salgısını 0. gün, 1. gün, 3. gün, 5. gün, 7. gün, 11. gün, 15. gün ve 19. günde ölçün.
6. Kornea floresein boyama
- Her sıçanın alt konjonktival kesesine 0.5 μL% 0.5 floresein sodyum çözeltisi bırakın.
- Floresein damlatıldıktan sonra korneayı 3 dakika boyunca mavi ışık altında gözlemleyin.
- Her sıçanın korneasının floresan boyamasını kaydedin ve kornea kusuru olup olmadığını gözlemleyin.
- 0. gün, 1. gün, 3. gün, 5. gün, 7. gün, 11. gün, 15. gün ve 19. günde korneal floresein boyama işlemi gerçekleştirin.
7. Konjonktival dokunun histolojik gözlemi
- Model geliştirmeyi tamamladıktan sonra, hayvanların gerginliğini hafifletmek için sıçanları 0.4 mL / 100 g% 10 sulu kloral hidrat intraperitoneal enjeksiyonu ile derinlemesine uyuşturun. Daha sonra, sıçanları servikal çıkık ile ötenazi yapın.
- Bulbar konjonktivayı her sıçanın aynı bölgelerinden, yaklaşık 2 mm x 2 mm boyutlarında alın.
- Dokuları hemen% 4 paraformaldehit içinde 24 saat sabitleyin ve parafin13 içine gömün.
- 5 μm kalınlığında kesitler kesin ve hematoksilen ve eozin (HE)14 ve periyodik asit-Schiff (PAS) boyası ile boyayın (üreticinin talimatlarına uyun).
8. Kornea ve gözyaşı bezi dokusunun histolojik gözlemi
- Model geliştirmeyi tamamladıktan sonra, adım 7.1'de açıklandığı gibi sıçanı ötenazi yapın.
- Korneayı her sıçanın sağ tarafına alın ve hemen% 4 paraformaldehit çözeltisine sabitleyin.
- Sefalik epidermisi ve deri altı dokusunu kulağı ve gözün dış köşesini birbirine bağlayan çizgi boyunca kesin, kesiyi her iki tarafa genişletin ve sarımsı ekstra orbital bezi daha da izole edin.
- Sıçanın kürkünü iyice çıkarın ve ekstraorbital bezi% 0.9 sodyum klorür çözeltisi ile ayırın.
- İzole edilmiş ekstraorbital bezleri 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit çözeltisine yerleştirin ve parafine gömün.
- ~5 μm kalınlığında sürekli kesitler kesin ve kornea ve ekstraorbital bez dokusu örnekleri için bunları HE ile boyayın.
9. İstatistiksel analiz
- Verilerin istatistiksel analizi için uygun yazılımı kullanın.
- Verileri analiz etmek için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve gruplar arasında karşılaştırma için en az anlamlı fark (LSD) testi yapın. İstatistiksel anlamlılık düzeyini α = 0.05 olarak ayarlayın, P < 0.05 istatistiksel anlamlılığı gösterir.
NOT: Deneysel verilerin istatistiksel analizi için SPSS 20 paket programı kullanılmıştır.
- Verileri analiz etmek için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve gruplar arasında karşılaştırma için en az anlamlı fark (LSD) testi yapın. İstatistiksel anlamlılık düzeyini α = 0.05 olarak ayarlayın, P < 0.05 istatistiksel anlamlılığı gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Schirmer I testi, SIT I
Sıçanların gözyaşı hacmi, deneyin başlamasından sonraki 0, 3, 5, 7, 11, 15 ve 19. günlerde ölçüldü. Deneysel sonuçlar, skopolamin grubunun (2.5 grup, 5 grup, 7.5 grup) gözyaşı sekresyonunun kontrol grubuna (0 grup) göre anlamlı olarak azaldığını ve farkın istatistiksel olarak anlamlı olduğunu gösterdi (P < 0.01). 2.5 grubu, 5 grubu ve 7.5 grubu arasında istatistiksel anlamlılık yoktu (P > 0.05). Gün sayısı açısından farklı gruplar arasında anlamlı fark gözlenmedi (P > 0.05) (Şekil 1, Tablo 1).
Kornea floresein boyama
Kornea floresein boyaması deneyin 0, 3, 5, 7, 11, 15 ve 19. günlerinde yapıldı. Sonuçlar, hiçbir grupta korneal floresein boyaması olmadığını gösterdi, bu da farklı konsantrasyonlarda skopolamin ilaçları ile yapılan 20 günlük deney sırasında belirgin bir kornea epitel defekti oluşmadığını gösterdi (Şekil 2).
Kornea epitelinin patolojik analizi
Deneyden sonra, kornea epitelinin morfolojisini gözlemlemek ve kornea epitel tabakasının kalınlığını ölçmek için her sıçandan HE boyama için kornea dokuları toplandı. Kontrol grubunun kornea epiteli, 4-6 kat düzenli olarak düzenlenmiş epitel hücrelerinden oluşuyordu, bunların arasında bazal tabaka düzgün ve yakın bir şekilde düzenlenmiş tek bir kolumnar epitel hücresi katmanından oluşuyordu. Grup 2.5, 5 ve 7'nin kornea epiteli, düzleştirilmiş ve atrofik hücre morfolojisi ve düzensiz hücre yapısı ile kontrol grubundan önemli ölçüde daha inceydi. Grup 7.5'te bazal tabakada gevşek hücreler arası bağlantı ve vakuolar yapı mevcuttu ( Şekil 3'te kırmızı okla gösterilmiştir). Skopolamin gruplarının kornea epiteli ile karşılaştırıldığında, normal kontrol grubunun kornea epiteli, kornea epitel tabakasının kalınlığında istatistiksel farklılıklar gösterdi (Şekil 4).
Gözyaşı bezinin patolojik analizi
Sıçanlarda gözyaşı sekresyonu için ana bez ekstrorbital gözyaşı bezidir15. Lakrimal bez dilimleri gözlenirken, skopolamin konsantrasyonunun artmasıyla, inflamasyon ve doku ödeminin eşlik ettiği gözyaşı bezi epitel hücrelerinin morfolojisinde değişiklikler gözlendi. Kontrol grubunda böyle bir değişiklik gözlenmedi. Patoloji sonuçları, gözyaşı bezinin inflamatuar değişikliklerinin, hücre ödeminin ve glandüler epitel hücrelerinin atrofisinin gözyaşı bezinin fonksiyonel hasarı için gösterge olarak kullanılabileceğini düşündürmektedir16 (Tablo 2). Bu göstergeler, gözyaşı sekresyonu miktarına bağlı olarak kuru gözün şiddetini ölçmek için kullanılabilir (Şekil 5).
Konjonktival boyama sonuçlarının analizi
Kontrol grubundaki konjonktivanın yapısı, esas olarak yüzey tabakası ve lamina propriadan oluşan tamamlanmıştır. Yüzey tabakası, hücre yüzeyinde mikrovilluslar bulunan, pürüzsüz ve eksiksiz lamine sütunlu epitel hücreleridir. Epitel hücreleri arasında, hücre sitoplazmasında büyük hücre hacmi ve mukoza granülleri ile dağınık goblet hücreleri mevcuttu. Üç skopolamin ilaç grubunda konjonktival epitelin yüzey tabakası belirgin olarak daha inceydi, mikrovillus ve goblet hücrelerinin sayısı azalmıştı, hücre dizilim yapısı eksikti, ödem eşlik ediyordu ve HE boyamasında gözlendiği gibi az miktarda inflamatuar hücre vardı (Şekil 6).
Konjonktivanın PAS ile boyanmasıyla, her farenin üç bağımsız örneğinde 40x mikroskobik alan başına ortalama goblet hücresi sayısı hesaplandı ve ortalama SD ± olarak ifade edildi (Şekil 7).
Şekil 1: Her gruptaki Schirmer test değerinin istatistikleri (mm) Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Sıçan korneasının floresein sodyum boyaması. Floresein sodyum ile yapılan 20 günlük deneyde, tüm sıçanların kornealarında pozitif bulgu gözlenmedi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kornea epitel boyaması ve kalınlık ölçümü. Grup 7.5'te bazal tabakada gevşek hücreler arası bağlantı ve vakuolar yapı vardı (kırmızı okla gösterilir) Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Her grupta kornea epitel kalınlığı istatistikleri. Skopolamin gruplarının kornea epiteli ile karşılaştırıldığında, normal kontrol grubunun kornea epiteli, kornea epitel tabakasının kalınlığında istatistiksel farklılıklar gösterdi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Sıçanların ekstrorbital lakrimal bezinin HE boyama sonuçları. (A) Grup 0: Görme alanında, gözyaşı bezleri lobüler yapı gösterir ve kanalların morfolojisinde belirgin bir anormallik olmaksızın kanallar ve tübüler bezlerden oluşurken, tübüler bezler sitoplazmada bol miktarda mukoza maddesi bulunan koni biçimli glandüler hücrelerden oluşurken, bağ dokularında belirgin ödem yok, interstisyel kan damarlarında belirgin anormallik yok ve belirgin nekroz ve enflamatuar hücre infiltrasyonu yok. (B) Grup 2.5: Görme alanında, lakrimal bez epitel hücrelerinde ara sıra atrofisi gözlenir, hacim azalması, düzensiz şekilli genişlemiş glandüler boşluklar ve boşluk içinde müsinöz madde azalması (kırmızı okla gösterilir). Stromada (mavi okla gösterilir) ara sıra serbest lenfositlerin infiltrasyonu da vardır, ancak kanal morfolojisinde belirgin bir anormallik veya ödem belirtisi gözlenmez. (C) Grup 5: Görme alanında, lakrimal epitel hücreleri zaman zaman atrofik olmuş ve boyut olarak küçülmüş, glandüler kavite genişlemiş, kavitedeki mukoza maddesi azalmış (kırmızı ok) ve stromada zaman zaman serbest lenfosit infiltrasyonu gözlenmiştir (mavi ok) ve kanal morfolojisinde belirgin bir anormallik veya lakrimal bez lobülleri arasındaki bağ dokusu ödemi gözlenmemiştir. (D) Grup 7.5: Görme alanında ödem görülebilir; gözyaşı bezleri arasındaki boşluk genişler ve düzenleme düzensizdir (yeşil ok), gözyaşı bezlerinin epitel hücreleri sıklıkla körelir, hacim küçülür ve şekil düzensizdir (sarı ok), bazen bez boşluğu genişler, boşluktaki mukoza maddesi azalır (kırmızı ok), bazen serbest lenfosit sızar (mavi ok), kanal morfolojisinde belirgin bir anormallik olmadan. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Sıçan konjonktivasının HE boyaması. Kontrol grubunun konjonktival epiteli ile karşılaştırıldığında, skopolamin ilaçlı konjonktival epitelin her üç grubu da değişen derecelerde yapısal hasar gösterdi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Konjonktivanın PAS boyaması. (A) Normal kontrol sıçanları. (B) skopolamin grubu sıçanlar. (C) Her grupta kadeh hücre yoğunluğu (20x). Siyah çubuk = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Schirmer I testi, SIT(Ortalama değer, birim [mm]) | |||||||
| Grup | 0 gün | 3 gün | 5 gün | 7 gün | 11 gün | 15 gün | 19 gün |
| 0 | 6 | 4.2 | 5 | 8 | 7 | 5.5 | 6.3 |
| 2.5 | 2 | 2.7 | 2 | 2.7 | 3.3 | 3.7 | 3 |
| 5 | 2.3 | 2.7 | 1.7 | 2.3 | 3.2 | 3.7 | 3 |
| 7.5 | 2.3 | 3.2 | 2.5 | 2.8 | 2.7 | 3.2 | 2.8 |
Tablo 1: Dört gruptaki sıçanların farklı zaman noktalarında (mm) Schirmer testi. İlaç uygulandıktan sonra, sıçanlarda gözyaşı salgılanması önemli ölçüde azaldı.
| Sayı | Nekroz | Enflamasyon | Ödem | Epitelyal atrofi |
| 0 Grp-1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 Grp -2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 Grp -3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2.5 Grp -1 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 2.5 Grp -2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2.5 Grp -3 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 Grp -1 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 Grp -2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 Grp -3 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| 7.5 Grp -1 | 0 | 1 | 2 | 1 |
| 7.5 Grp -2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 7.5 Grp -3 | 0 | 1 | 2 | 2 |
Tablo 2: Sıçan gözyaşı bezinin patolojik doku skoru. Puanlama kriterleri: 0: Normal şartlarda hayvan yaşı, cinsiyet, suş gibi faktörler göz önünde bulundurularak doku normal kabul edilir;
1: Gözlemlenen değişiklikler normal aralığı aştı; 2: Lezyonlar görülebilir, ancak henüz şiddetli değildir; 3: Lezyonlar belirgindir ve kötüleşmeye devam eder; 4: Lezyonlar son derece şiddetlidir ve tüm dokuyu etkilemiştir16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sulu eksikliği olan kuru göz (ADDE), toplam kuru göz popülasyonunun yaklaşık 1/3'ünü oluşturan önemli bir kuru göz türüdür17 ve ADDE'nin ana nedeni gözyaşı bezi patolojik hasarı ve inflamasyonudur13. Bu tip kuru göz için en yaygın klinik tedavi yöntemleri, semptomları hafifletmek için suni gözyaşları veya steroid veya siklosporin18'in topikal uygulamasıdır, ancak gözyaşı bezine verilen hasar için çok az tedavi seçeneği vardır. Bu nedenle, gözyaşı bezi fonksiyon rekonstrüksiyonunun kuru göz üzerindeki etkisini araştırmak ve gözyaşı bezi disfonksiyonunun bir hayvan modelini oluşturmak çok önemlidir. Sıçanlarda gözyaşı bezinin salgılanmasını baskılamak için tekrarlanan bir ilaç uygulama yöntemi kullandık ve kronik gözyaşı bezi disfonksiyonu kuru göz hayvan modeli oluşturduk.
Diğer hayvan modellerine göre daha fazla avantaja sahip olan bu kuru göz modelini oluşturmak için fareleri seçtik19. Örneğin, tavşanlar daha büyük bir vücut büyüklüğüne sahiptir ve istenen etkiyi elde etmek için daha fazla ilaç dozu veya daha sık enjeksiyon gerektirir. Dahası, tavşanlar biraz daha pahalıdır, bu da deney için daha fazla maliyet anlamına gelir. Fareler ayrıca oftalmik araştırmalarda da yaygın olarak kullanılır, ancak genellikle Sjögren sendromu modellerini oluşturmak için kullanılırlar20. Bu modeller, immünopatolojik mekanizmaları araştırmak için organ inflamasyonu ve lenfosit infiltrasyonunu karşılaştırmaya odaklanmaktadır. Fareler küçük vücut boyutlarına, karmaşık gözyaşı bezi anatomisine ve düşük gözyaşı salgısına sahiptir, bu da gözyaşı üretimini doğru bir şekilde yansıtmayı zorlaştırır. Sıçan hayvan modeli, uygun ilaç enjeksiyonlarına olanak sağlaması, nispeten basit beslenme koşullarına sahip olması, hem klinik hem de deneysel çalışmalara uygun olması ve ayrıca maliyet açısından avantajları olması nedeniyle daha uygun bir kuru göz modelidir. ADDE için iyi bir hayvan modelidir.
Sıçanın vücudundaki kolinerjik reseptörleri inhibe etmek, gözyaşı bezi sekresyonunu azaltmak ve gözyaşı bezi hücrelerinin patolojik yapısını değiştirmek için kolinerjik reseptör blokeri skopolamini uyguladık, bu da kuru göz hastalarında gözyaşı bezlerinin durumunu temel olarak simüle eder. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yaklaşım gözyaşı bezlerinin hasarlı durumunu doğal bir durumda daha iyi simüle eder. Benzalkonyum klorür göz damlası21 kullanmak veya nemi azaltmak ve oküler yüzey buharlaşmasınıartırmak 4,8 gibi dış koşulları değiştirmek gibi diğer yöntemler sadece oküler yüzey ortamını bozar ve gözyaşı bezinin fonksiyonel durumunu değiştirmez. Bu nedenle uzun süreli, kronik göz kuruluğu rahatsızlıkları için uygun değildirler.
Sıçanlarda gözyaşı salgı hacmini ölçerken, Schirmer gözyaşı test şeritlerini geliştirdik. İlk olarak, insanlar tarafından kullanılan yırtılma test şeridini merkez hattı boyunca kestik. Daha sonra, üst kısmı yuvarlak bir yay şeklinde kestik ve sıçanın alt konjonktival kesesine kolayca yerleştirmeyi kolaylaştırmak için yavaşça üstten geriye katladık. Sıçanların aktif olduğu ve 5 dakika boyunca gözyaşlarını ölçmenin zor olduğu unutulmamalıdır. Schirmer gözyaşı test şeridini sıçanın alt konjonktival kesesine yerleştirdikten sonra, rahatlıklarını artırmak ve ölçüm sonuçlarını etkileyebilecek uzun gözyaşı ölçümü sırasında mücadele etmekten kaçınmak için sıçanın gözlerini manuel olarak kapattık.
Gözyaşı bezi çıkarılırken öncelikle yerini tespit etmek gerekir. Gözyaşı bezi lokalizasyonu noktası, kulağın ön kısmı ile iç kantus arasındaki orta noktadır. Ardından, kürkün altındaki deri dokusunu kesin, parçalanmış kürkün girişini en aza indirin ve sonraki aşamada taşıma sürecini azaltın. Ekstraksiyon işlemi sırasında, parçalanmış kürkün zamanında temizlenmesi de önemlidir. Özellikle gözyaşı bezini ayırırken, tekrar tekrar durulamak için fosfat tamponlu salin (PBS) veya salin kullanın ve kesit sonuçlarını etkileyebilecek diğer dokularla karışmaktan kaçının.
Geliştirilen kuru göz hayvan modelinin avantajı, protokolün farklı ilaç konsantrasyonlarını farklı derecelerde gözyaşı bezi hasarı ile ilişkilendirmesidir. Bu, gözyaşı bezi disfonksiyonunun tedavisinin incelenmesi için deneysel bir temel sağlar. Bir araştırmacı için daha ayrıntılı referans materyalleri sağlamak için modelleme sürecindeki bazı operasyonel adımları iyileştirdik. Ek olarak, kuru göz hayvan modeli için kornea, konjonktiva ve gözyaşı bezinin morfolojik göstergelerini içeren, konjonktival hücreleri sayan ve gözyaşı bezi hasarının derecesini puanlayan analiz göstergeleri ekledik. Gözyaşı bezi fonksiyonunu inflamasyon, ödem ve atrofiden değerlendirdik. Kuru göz ve gözyaşı bezi disfonksiyonunun derecesini yansıtmak için en kapsamlı, uygun maliyetli ve doğru analiz yöntemlerini seçtik.
Bununla birlikte, yöntemimizin de bazı sınırlamaları vardır. Hayvan modelleri oluşturmanın uzun süreci nedeniyle, deneycilerin tekrar tekrar enjekte etmesi gerekir. Şu anda ilaç pompaları veya transdermal yamalar gibi manuel enjeksiyonların yerini alacak bazı yöntemler olmasına rağmen, kullanımlarında hala bazı komplikasyonlar vardır. İlaç sıklığını azaltmak, komplikasyonların ortaya çıkmasını önlemek ve dozajın doğruluğunu sağlamak için daha iyi yöntemlerin nasıl uygulanacağı bir sonraki hedefimizdir. Sonuç olarak, ADDE'de gözyaşı bezi disfonksiyonu üzerine araştırmalar için deneysel bir temel sağlayarak, skopolamin enjeksiyonunun neden olduğu kuru bir göz hayvan modelini geliştirdik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların bu prosedürde kullanılan ilaçlar ve materyallerle ilgili potansiyel çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Guangdong Eyaleti Üst Düzey Klinik Anahtar Uzmanlıkları (SZGSP014) ve Shenzhen Doğa Bilimleri Vakfı (JCYJ20210324125805012) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride solution | SJZ No.4 Pharmaceutical | H13023201 | |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd | G1113 | |
| Absolute ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips | Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd | YN-YG-I | |
| Hematoxylin and eosin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D006 | |
| Neutral balsam | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | G8590 | |
| Paraffin | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | YA0012 | |
| Periodic Acid-Schiff Staining Kit | Beyotime Biotechnology | C0142S | |
| Schirmer tear test strips | Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd | YN-LZ-I | |
| Scopolamine hydrobromide | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | S860151 | |
| Small animal microscope | Head Biotechnology Co,. Ltd | ZM191 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 |
References
- Papas, E. B. The global prevalence of dry eye disease: A Bayesian view. Ophthalmic Physiol Opt. 41 (6), 1254-1266 (2021).
- Sy, A., et al. Expert opinion in the management of aqueous deficient dry eye disease (DED). BMC Ophthalmol. 15 (1), 133 (2015).
- Seo, Y., et al. Activation of HIF-1alpha (hypoxia inducible factor-1alpha) prevents dry eye-induced acinar cell death in the lacrimal gland. Cell Death Dis. 5 (6), 1309 (2014).
- Rahman, M. M., Kim, D. H., Park, C. -K., Kim, Y. H. Experimental models, induction protocols, and measured parameters in dry eye disease: Focusing on practical implications for experimental research. Int J Mol Sci. 22 (22), 12102 (2021).
- Sullivan, D. A., Bloch, K. J., Allansmith, M. R. Hormonal influence on the secretory immune system of the eye: androgen regulation of secretory component levels in rat tears. J Immunol. 132 (3), 1130-1135 (1984).
- Sullivan, D. A., Allansmith, M. R. Hormonal modulation of tear volume in the rat. Exp Eye Res. 42 (2), 131-139 (1986).
- Maitchouk, D. Y., Beuerman, R. W., Ohta, T., Stern, M., Varnell, R. J. Tear production after unilateral removal of the main lacrimal gland in squirrel monkeys. Arch Ophthalmol. 118 (2), 246-252 (2000).
- Barabino, S., et al. The controlled-environment chamber: a new mouse model of dry eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (8), 2766-2771 (2005).
- Viau, S., et al. Time course of ocular surface and lacrimal gland changes in a new scopolamine-induced dry eye model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (6), 857-867 (2008).
- Altinors, D. D., Bozbeyoglu, S., Karabay, G., Akova, Y. A. Evaluation of ocular surface changes in a rabbit dry eye model using a modified impression cytology technique. Curr Eye Res. 32 (4), 301-307 (2007).
- Daull, P., et al. Efficacy of a new topical cationic emulsion of cyclosporine A on dry eye clinical signs in an experimental mouse model of dry eye. Exp Eye Res. 153, 159-164 (2016).
- Dursun, D., et al. A mouse model of keratoconjunctivitis sicca. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (3), 632-638 (2002).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R.
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Shinomiya, K., Ueta, M., Kinoshita, S. A new dry eye mouse model produced by exorbital and intraorbital lacrimal gland excision. Sci Rep. 8 (1), 1483 (2018).
- Ramos, M. F., et al. Nonproliferative and Proliferative Lesions of the Rat and Mouse Special Sense Organs(Ocular [eye and glands], Olfactory and Otic). J Toxicol Pathol. 31, (2018).
- Stapleton, F., et al. TFOS DEWS II Epidemiology report. Ocul Surf. 15 (3), 334-365 (2017).
- Foulks, G. N., et al. Clinical guidelines for management of dry eye associated with Sjogren disease. Ocul Surf. 13 (2), 118-132 (2015).
- Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Exp Ther Med. 22 (6), 1394 (2021).
- Brayer, J. B., Humphreys-Beher, M. G., Peck, A. B. Sjogren's syndrome: immunological response underlying the disease. Arch Immunol Ther Exp (Warsz. 49 (5), 353-360 (2001).
- Lin, Z., et al. A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride). Mol Vis. 17, 257-264 (2011).
