El protocolo describe un método eficiente y fiable para cuantificar la longitud poli(A) del gen de interés del sistema nervioso de Drosophila , que puede adaptarse fácilmente a tejidos o tipos celulares de otras especies.
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Artículo de método
Medición de la longitud de la cola de Poly A a partir del cerebro y la línea celular de la larva de Drosophila
En este artículo
Resumen
Resumen
La poliadenilación es una modificación postranscripcional crucial que agrega colas de poli(A) al extremo 3' de las moléculas de ARNm. La longitud de la cola de poli(A) está estrechamente regulada por procesos celulares. La desregulación de la poliadenilación del ARNm se ha asociado con una expresión génica anormal y diversas enfermedades, como el cáncer, los trastornos neurológicos y las anomalías del desarrollo. Por lo tanto, comprender la dinámica de la poliadenilación es vital para desentrañar las complejidades del procesamiento del ARNm y la regulación génica postranscripcional.
Este artículo presenta un método para medir la longitud de la cola de poli(A) en muestras de ARN aisladas de cerebros de larvas de Drosophila y células S2 de Drosophila Schneider. Empleamos el enfoque de relavesa guanosina/inosina (G/I), que implica la adición enzimática de residuos G/I en el extremo 3' del ARNm utilizando poli(A) polimerasa de levadura. Esta modificación protege el extremo 3' del ARN de la degradación enzimática. A continuación, las colas de polietileno (A) protegidas se transcriben a la inversa utilizando un cebador antisentido universal. Posteriormente, la amplificación por PCR se realiza utilizando un oligonucleótido específico del gen que se dirige al gen de interés, junto con un oligonucleótido de secuencia universal utilizado para la transcripción inversa.
Esto genera productos de PCR que abarcan las colas de poli(A) del gen de interés. Dado que la poliadenilación no es una modificación uniforme y da lugar a colas de diferentes longitudes, los productos de PCR muestran una gama de tamaños, lo que da lugar a un patrón de frotis en el gel de agarosa. Por último, los productos de PCR se someten a electroforesis en gel capilar de alta resolución, seguida de la cuantificación utilizando los tamaños de los productos de PCR poli(A) y el producto de PCR específico del gen. Esta técnica ofrece una herramienta sencilla y fiable para analizar las longitudes de la cola de poli(A), lo que nos permite obtener una visión más profunda de los intrincados mecanismos que gobiernan la regulación del ARNm.
Introducción
La mayoría de los ARNm eucariotas están poliadenilados postranscripcionalmente en su extremo 3' en el núcleo mediante la adición de adenosinas no moldeadas por poli(A) polimerasas canónicas. Una cola de poli(A) intacta es fundamental a lo largo del ciclo de vida del ARNm, ya que es esencial para la exportación nuclear de ARNm1, facilita la interacción con las proteínas de unión a poli(A) para mejorar la eficiencia de la traducción2 e imparte resistencia contra la degradación3. En ciertos casos, la cola de poli(A) también puede sufrir una extensión en el citoplasma, facilitada por poli(A) polimeras....
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Protocolo
1. Cría y selección de larvas de Drosophila
- Mantener/cultivar la cepa de mosca (w1118, wildtype) en un medio estándar de alimentación para moscas a 25 °C en una incubadora humidificada.
- Seleccione 10 larvas errantes de 3er estadio 72 h después de la puesta de huevos.
- Coloque las larvas en una placa de Petri vacía de 35 mm y lávelas suavemente transfiriendo las larvas a la nueva placa que contiene agua del grifo con fórceps. Haga esto 2 veces para eliminar cualquier resto de comida.
2. Aislamiento cerebral de
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Resultados
Aquí, analizamos la longitud de la cola de poli(A) de Dscam1 y GAPDH de cerebros de larvas de Drosophila (Figura 4). Los ARN aislados se visualizaron en un gel de agarosa para el control de calidad. Una sola banda de ARN con un tamaño de alrededor de 600 nucleótidos indica una preparación de ARN intacta (Figura 2A). Los ARN se sometieron a la electroforesis capilar de alta resolución y a la electroforesis capilar de alta resolución uti.......
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Discusión
En este protocolo, describimos la técnica para diseccionar el cerebro de la larva de Drosophila de la etapa errante del3er estadio, así como la preparación de la muestra de células de Drosophila S2. Debido a la naturaleza lábil de los ARNm, la recolección de muestras requiere precaución adicional. Para la disección del cerebro de las larvas, los cerebros no deben dañarse durante el aislamiento y no deben mantenerse en solución durante un período prolongado. Es esencial mantener el tiempo de d.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue financiado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (National Institute of Neurological Disorders and Stroke Grant R01NS116463 to J.K., y el Centro de Imágenes Celulares y Moleculares de la Universidad de Nevada, Reno, que contó con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud Grant P20GM103650 y se utilizó para la investigación informada en este estudio.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ácido 3-(N-morfolino) propanosulfónico (MOPS)Producto | de investigación Internacional (RPI) | M92020 | |
| Kit de ADN de alta sensibilidad Agilent | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent software 2100 experto descarga gratuita demo | Agilent Technologies | https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259 | |
| Apex 100 bp-Low DNA Ladder | Genesee Scientific | 19-109 | |
| Bioanalyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C | ||
| Pirocarbonato de dietilo (DEPC) | Investigación de productos internacionales (RPI) | D43060 | |
| Tinte de ADN (Tinte de carga de gel, púrpura (6x) | New England biolabs | B7024S | |
| Drosophila S2 línea celular | Drosophila Genomics Resource Center stock #181 | ||
| Drosophila Schneider' s Medio | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| Bromuro de ehidio | Genesee scientific | 20-276 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Pinzas Dumont 5 | Herramientas de Bellas Ciencias | 11254-20 | |
| Agua libre de nucleasa | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| PBS 10x | Investigación Interna de Productos (RPI) | P32200 | |
| Kit de ensayo de longitud de cola Poly(A) | Thermo Fisher Scientific | 764551KT | |
| RiboRuler Escalera de ARN de bajo rango | Thermo Fisher Scientific | SM1833 | |
| Colorante de carga de gel de ARN (2x) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | |
| Kit de micropreparación de ARN | Zymoresearch | R1050 | |
| Kit de minipreparación de ARN | Zymoresearch | Tijeras R1055-Tijeras | |
| de resorte Vannas - 2,5 mm Herramientas | ciencia fina de filo | 15000-08 | |
| TopVision Tabletas de Agarosa | Thermo Fisher Scientific | R2802 | |
| Tris-Acetato-EDTA (TAE) | Thermo Fisher Scientific | B49 |
Referencias
- Stewart, M. Polyadenylation and nuclear export of mRNAs. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 2977-2987 (2019).
- Machida, K., et al. Dynamic interaction of poly(A)-binding protein with the ribosome. Scientific Reports. 8 (1), 17435(2018).....
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Reimpresiones y permisos
