Generación de retina neural a partir de células madre pluripotentes humanas

Summary

El presente protocolo describe un sistema de inducción neuronal de retina 3D optimizado que reduce la adhesión y fusión de organoides retinianos con alta repetibilidad y eficiencia.

Abstract

La retinopatía es una de las principales causas de ceguera en todo el mundo. Investigar su patogenia es fundamental para el diagnóstico precoz y el tratamiento oportuno de la retinopatía. Desafortunadamente, las barreras éticas dificultan la recopilación de evidencia de los seres humanos. Recientemente, numerosos estudios han demostrado que las células madre pluripotentes humanas (PSC) se pueden diferenciar en organoides de la retina (RO) utilizando diferentes protocolos de inducción, que tienen un enorme potencial en la retinopatía para el modelado de enfermedades, el cribado de fármacos y las terapias basadas en células madre. En este estudio se describe un protocolo de inducción optimizado para generar retina neural (NR) que reduce significativamente la probabilidad de vesiculación y fusión, aumentando la tasa de éxito de la producción hasta el día 60. Basado en la capacidad de las PSC para autoreorganizarse después de la disociación, combinado con ciertos factores complementarios, este nuevo método puede impulsar específicamente la diferenciación de NR. Además, el enfoque es sencillo, rentable, exhibe una notable repetibilidad y eficiencia, presenta perspectivas alentadoras para modelos personalizados de enfermedades de la retina y proporciona un abundante reservorio celular para aplicaciones como la terapia celular, la detección de fármacos y las pruebas de terapia génica.

Introduction

El ojo sirve como la principal fuente de información entre los órganos sensoriales humanos, siendo la retina el principal tejido sensorial visual^{en los ojos} de los mamíferos. La retinopatía se erige como una de las principales causas mundiales de enfermedades oculares, lo que conduce a la ceguera². Aproximadamente 2,85 millones de personas en todo el mundo sufren diversos grados de discapacidad visual debido a la retinopatía³. En consecuencia, la investigación de su patogenia es crucial para el diagnóstico precoz y el tratamiento oportuno. La mayoría de los estudios sobre retinopatía humana se han....

Protocol

Este estudio se realizó de acuerdo con los Principios de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética Institucional del Hospital General del EPL de China. La línea ESC WA09 (H9) se obtuvo del WiCell Research Institute.

1. Medios de cultivo y preparación de reactivos

1. Medio de cultivo ESC humano y solución de paso
   1. Medio de mantenimiento (MM): Preparar 500 mL de MM completo (Medio Basal + 5x suplemento; ver Tabla de Materiales) de forma aséptica. Descongele 5 veces el suplemento a temperatura ambiente (RT) o durante la noche a 2-8 °C. Precalentar a RT. Revuelva bien antes ....

Results

En la Figura 1 se muestra una descripción gráfica del protocolo modificado. Las H9-ESC se utilizaron para generar RO cuando las células crecieron a una densidad del 70%-80%. Las suspensiones de una sola célula de H9-ESC en 96 pozos cónicos con fondo en V se agregaron el día 1 y formaron EB redondos bien circunscritos en el día 6. A medida que aumentaba el tiempo de cultivo, el volumen de EB aumentaba gradualmente. En el día 30, las estructuras de tipo neuroepitelial se formaron claramente y .......

Discussion

Las OR humanas pueden recapitular espacial y temporalmente el desarrollo de la retina fetal, y las OR tempranas exhiben un alto grado de similitud con la retina fetal en etapas equivalentes de desarrollo¹⁵. En términos de morfología tisular y expresión molecular, la ósmosis inversa humana refleja de cerca el estado de crecimiento real del tejido de la retina, lo que brinda oportunidades enormes y sin precedentes en los campos del modelado de enfermedades, la detección de medicamentos y la medicina.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01 M TPBS	Servicebio	G0002	Lonchas de lavado
4% Paraformaldehído	Servicebio	G1101-500ML	Fix organoides de retina
5 mL Pipeta	Pasteur NEST Biotechnology	318516	Pipeta organoides de retina 96
pocillos cónicos con fondo en V	Sumitomo Bakelit	MS-9096VZ
Portaobjetos de microscopio de adherencia	CITOTEST	188105	Fix rebanadas
AggreWell medio	STEMCELL Technologies	5893	Medio
Etanol anhidro	SINOPHARM	10009218	Deshidratado
Anti-CHX10	Santa Cruz	sc-365519	Anticuerpo primario
Solución Antidesvanecimiento	ZSGB-BIO	ZLI-9556
Anti-KI67	Abcam	ab16667	Anticuerpo primario
Anti-NESTIN	Sigma	N5413	Anticuerpo primario
Anti-Neuronal Clase III β-Tubulina (TUJ1)	Beyotime	AT809	Anticuerpo primario
Anti-PAX6	Abcam	ab195045	Anticuerpo primario
Solución de disociación celular (CDS)	STEMCELL Technologies	7922	Disociación celular
CHIR99021	Selleckchem	S2924	GSK-3α/β inhibidor
Colesterol Concentrado de lípidos	Gibco	12531018	250×
Servicio	de solución de recuperación de antígenos de citratobio	G1202-250ML	20×, pH 6.0
CS10	STEMCELL Technologies	1001061	medio de congelación celular
DAPI	Roche	10236276001	Contratinción nuclear
Dimethyl sulfóxido (DMSO)	Sigma	D2650
DMEM/F12	Gibco	11330032	Medio
DMEM/F12-GlutaMAX	Gibco	10565018	Burro Medio
anti-Ratón Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32766	Anticuerpo Secundario
Burro anti-Conejo Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10042	Anticuerpo Secundario
Etileno Diamino Ácido Tetracacético (EDTA)	Biosharp	BL518A	0,5 M, pH 8,0, disociación celular
Matriz extracelular (ECM)	Corning	354277	Placas de recubrimiento
F12-Glutamax	Gibco	31765035	Medium
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5669701
Analizador cuantitativo de células tisulares Flow-like	TissueGnostics	TissueFAXS Plus	Secciones de escaneo
IMDM-GlutaMAX	Gibco	31980030	Medio
IWR1-endo	Selleckchem	S7086	Inhibidor de Wnt
KnockOut Serum de reemplazo	Gibco	10828028
LDN-193189 2HCl	Selleckchem	S7507	Inhibidor de BMP
Placas de 24 pocillos de baja adherencia	Corning	3473
Placas de 6 pocillos de baja adherencia	Corning	3471
Medio de mantenimiento (MM)	STEMCELL Technologies	85850
Suplemento medio N2	Gibco	17502048
Normal Donkey Serum	Solarbio	SL050	Tampón bloqueante
Paraplast	Leica	39601006	Incrustación de tejido
PBS pH 7.4 básico (1x)	Gibco	C10010500BT	Sin Ca+,Mg+
Reconbinante proteína morfogenética ósea humana-4(rhBMP4)	R& D	314-BP	Factor proteico clave
Ácido retinoico	Sigma	R2625	Polvo, mantener alejado de la luz
SB431542	Selleckchem	S1067	Inhibidor de ALK5
SU5402	Selleckchem	S7667	Inhibidor de la tirosina quinasa
Super PAP Pluma	ZSGB-BIO	ZLI-9305
Taurina	Sigma	T0625-10G
Tioglicerol	Sigma	M1753
Triton X-100	Sigma	X100	Permeabilización
Línea de células madre embrionarias WA09	WiCell Research Institute		Línea celular
Xileno	SINOPHARM	10023418	Desparafinado
Y-27632 2HCL	Selleckchem	S1049	ROCK-inhibidor