Este artículo presenta una técnica única de tórax cerrado para inducir la lesión miocárdica por isquemia-reperfusión (IRI) en ratones. El método presentado permite a los ratones respirar espontáneamente mientras inducen isquemia miocárdica a distancia. Esto proporciona acceso al animal para estudiar los procesos dinámicos de isquemia y reperfusión in situ y en tiempo real a través de imágenes no invasivas.
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Artículo de método
Oclusión de la DA activada a distancia mediante un catéter de balón en ratones que respiran espontáneamente
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
El infarto agudo de miocardio (IAM) es una afección cardiovascular prevalente y de alta mortalidad. A pesar de los avances en las estrategias de revascularización para el IAM, con frecuencia conduce a una lesión por isquemia-reperfusión miocárdica (IRI), que amplifica el daño cardíaco. Los modelos murinos sirven como herramientas vitales para investigar tanto la lesión aguda como la remodelación crónica del miocardio in vivo. Este estudio presenta una técnica única de tórax cerrado para inducir a distancia la IRI miocárdica en ratones, lo que permite la investigación de la fase muy temprana de la oclusión y la reperfusión utilizando imágenes in vivo como la resonancia magnética o la PET. El protocolo utiliza un método de oclusión remota, lo que permite un control preciso sobre el inicio de la isquemia después del cierre del tórax. Reduce el trauma quirúrgico, permite la respiración espontánea y mejora la consistencia experimental. Lo que distingue a esta técnica es su potencial para la obtención simultánea de imágenes no invasivas, como la ecografía y la resonancia magnética (RM), durante los eventos de oclusión y reperfusión. Ofrece una oportunidad única para analizar las respuestas de los tejidos casi en tiempo real, proporcionando información crítica sobre los procesos durante la isquemia y la reperfusión. Se llevaron a cabo pruebas sistemáticas exhaustivas de este enfoque innovador, midiendo los marcadores de necrosis cardíaca para el infarto, evaluando el área en riesgo mediante resonancia magnética con contraste y tiñendo los infartos en la etapa de maduración de la cicatriz. A través de estas investigaciones, se hizo hincapié en el valor de la herramienta propuesta para avanzar en los enfoques de investigación de la lesión por isquemia-reperfusión miocárdica y acelerar el desarrollo de intervenciones específicas. En este trabajo se presentan los resultados preliminares que demuestran la viabilidad de combinar el innovador protocolo experimental propuesto con técnicas de imagen no invasivas. Estos resultados iniciales resaltan el beneficio de utilizar la cuna animal especialmente diseñada para inducir isquemia miocárdica de forma remota mientras se realizan simultáneamente resonancias magnéticas.
Introducción
El infarto agudo de miocardio (IAM), una enfermedad cardiovascular prevalente a nivel mundial, se asocia a altas tasas de mortalidad y morbilidad1. A pesar de los avances tecnológicos que permitieron estrategias de revascularización tempranas y efectivas para los pacientes con IAM, los pacientes aún experimentan lesión por isquemia-reperfusión miocárdica (IRI) después de estas intervenciones2. Por lo tanto, es crucial comprender los mecanismos fundamentales y formular enfoques para mitigar la IRI. La IRI representa un estado fisiopatológico complejo que involucra una multitud de procesos biológicos intrincados. Estos abarcan la muerte celular regulada, las respuestas al estrés oxidativo, la inflamación, la cicatrización de heridas, la fibrosis y la remodelación ventricular. Los modelos animales, como los ratones, han sido de gran importancia para la investigación del IRI y se emplean ampliamente debido a su rentabilidad, su rápida reproducción y la gran cantidad de información mecanicista de los modelos transgénicos3.
Este protocolo presenta una técnica innovadora para inducir IRI de forma remota en ratones que respiran espontáneamente con el tórax cerrado, imitando más de cerca la patología humana. La oclusión remota se logró mediante la utilización de un catéter balón colocado a una distancia del miocardio para ocluir la arteria descendente anterior (DA) izquierda. Este enfoque ofrece un acceso continuo al corazón latiendo en los momentos exactos de la oclusión y la reperfusión, lo que facilita las modalidades de imágenes simultáneas, incluidas las ecografías o las imágenes por resonancia magnética (RM). Estos métodos no invasivos podrían proporcionar información crucial sobre las respuestas de los tejidos antes, durante y después de los eventos de oclusión y reperfusión.
Existen diversas técnicas quirúrgicas para inducir IRI en modelos murinos. El trauma quirúrgico derivado de la toracotomía en modelos de ligadura coronaria a tórax abierto desencadena una respuesta inmune que impacta en diversos mecanismos asociados con la isquemia y la reperfusión. La activación del sistema inmunitario innato tiene el potencial de influir en la extensión del infarto de miocardio4. La técnica adaptada propuesta proporciona un enfoque potencial para explorar el pre y postacondicionamiento miocárdico y posiblemente reducir el impacto de la respuesta inmune innata al trauma quirúrgico en estudios murinos de IRI al minimizar el período de tiempo de tórax abierto a un máximo de 5 minutos. Además, la técnica recientemente desarrollada también podría contribuir a reducir las secuelas proinflamatorias causadas por la lesión pulmonar inducida por el ventilador5. Sin embargo, los efectos combinados de este nuevo método de tórax cerrado requerirían una investigación más profunda.
La validación exhaustiva de la técnica propuesta se realizó comparándola con el método tradicional, que consiste en exponer la DA mediante disección torácica quirúrgica y oclusión inducida por ligadura durante 30 min. Se compararon los resultados de ambas técnicas, que incluyeron mediciones de troponina que reflejaban el tamaño del infarto cardíaco, evaluaciones del área en riesgo mediante resonancia magnética con realce de contraste de gadolinio, tinción histológica de cloruro de trifenil tetrazolio (TTC) y la determinación del tamaño final de las cicatrices mediante tinción Sirius Red (SR). El resultado demuestra la robustez y eficacia del enfoque propuesto para estudiar la lesión por isquemia-reperfusión en modelos murinos.
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Protocolo
Este protocolo animal fue aprobado y está de acuerdo con las pautas y regulaciones establecidas por el Comité de Ética para la Experimentación Animal (ECD) de la Universidad Católica de Lovaina. Todas las políticas desarrolladas por el DIT local siguen la normativa de la Unión Europea relativa al bienestar de los animales de laboratorio, tal y como se declara en la Directiva 2010/63/UE. Todas las pruebas que se describen a continuación se han realizado en ratones machos C57BL/6 de 8-12 semanas de edad (peso corporal = 20-23 g). Los experimentos agudos representan animales que fueron sacrificados inmediatamente después de la cirugía. Los experimentos de supervivencia representaron un seguimiento de cuatro semanas, que incluyó la medición de troponina, la resonancia magnética y la tinción de SR.
1. Anestesia e intubación endotraqueal
- Administrar medicación preanestésica con una mezcla de ketamina (7,5 mg/kg; Nimatek 100 mg/mL), xilacina (1 mg/kg; Rompun, 20 mg/mL) y acepromazina (0,1 mg/kg; Placivet, 10 mg/mL) (KXA) (ver Tabla de Materiales) con diluyente salino al 0,9 % por vía intraperitoneal. Esto permite una intubación más suave y menos invasiva.
- Coloque el ratón en una cámara de inducción (ver Tabla de Materiales) e invoque la anestesia con isoflurano al 2,5% en oxígeno puro con un caudal de 1 L/min hasta la pérdida de enderezamiento y el reflejo de pinzamiento de la punta del pie.
- Transfiera el animal a una almohadilla térmica (±38 °C) y colóquelo en decúbito supino con la cabeza hacia el cirujano. Fije la cola y las patas delanteras con cinta adhesiva en la almohadilla. Asegúrese de que las extremidades delanteras no estén demasiado estiradas, ya que esto puede comprometer la respiración.
- Coloque una sutura de seda 2-0 (consulte la Tabla de materiales) alrededor de los incisivos superiores y pegue la sutura en el borde de la almohadilla para tensar el ratón. Si es necesario, coloque un soporte para agujas para mantener la tensión en la sutura. Mantener al animal anestesiado con isoflurano al 2% en oxígeno al 100% con un caudal de 1 L/min utilizando un cono nasal.
- Coloque una fuente de luz justo al rostral del esternón, retire el cono de la nariz y coloque el suministro de isoflurano en el ventilador. Intube al ratón con pinzas levantando la lengua hacia arriba y sosteniendo un laringoscopio de fabricación propia para levantar aún más la parte basal de la lengua y visualizar las cuerdas vocales.
- Coloque un tubo traqueal de fabricación propia con un catéter de 18 g en una aguja sin filo entre las cuerdas vocales. Suba el catéter, extraiga la aguja desafilada y conecte el tubo con el ventilador del ratón (consulte la tabla de materiales).
- Utilice un conector modificado en forma de Y (consulte la Tabla de materiales) para conectar el tubo de intubación al ventilador. La posición correcta del tubo traqueal se puede confirmar juzgando la expansión simétrica del tórax.
- Ajuste el volumen corriente (mL) al peso corporal (BW) (g) x 7 y la tasa de ventilación a 53,5 x (BW (g)-0,26) brazadas por minuto, y ajústelo al peso corporal de un ratón en particular si es necesario6 (por ejemplo, para un ratón de 25 g el volumen corriente es de 175 mL a 140 brazadas por min).
- Reducir el isoflurano al 1% en oxígeno al 100%, ya que el animal permanecerá anestesiado debido a la premedicación. Sin embargo, evalúe regularmente la profundidad de la anestesia realizando un pellizco en los dedos de los pies. Adapte la concentración de isoflurano en función de la profundidad de la anestesia.
- Aplique una gota de ungüento oftálmico para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
2. Instalación de la herramienta IRI
NOTA: Retire toda la cinta adhesiva y coloque el animal en la placa base de la herramienta IRI especialmente diseñada. Los detalles sobre las propiedades de la herramienta IRI se mencionan en el Archivo Complementario 1.
- Fije la placa base de la herramienta IRI remota especialmente diseñada en una posición lateral frente al cirujano. Fija la cola y las patas con cinta adhesiva. Fije la cabeza con la sutura de seda 2-0 alrededor de los incisivos superiores para evitar movimientos accidentales (Figura 1).
- Inserte la sonda térmica rectal (consulte la tabla de materiales) para controlar la temperatura corporal y utilice una lámpara de calentamiento infrarroja sobre el animal para mantener la temperatura alrededor de 37 °C. Preste atención a la distancia suficiente entre el animal y la lámpara para evitar el sobrecalentamiento.
- Coloque los electrodos de aguja de ECG en las cuatro patas para observar y registrar la frecuencia cardíaca y la forma de onda del ECG. Fije la sonda rectal y los electrodos de ECG a la plataforma con cinta adhesiva.
- Aplique la crema depilatoria en el lado izquierdo del tórax para eliminar el vello y crear un campo quirúrgico claro.
NOTA: Limite el tiempo de aplicación y preste atención a la eliminación completa de la crema para evitar quemaduras químicas.
3. Toracotomía
- Realice la preparación aséptica de la piel con la solución de Betadine, luego coloque un paño quirúrgico en el tórax izquierdo para garantizar un ambiente estéril. Utilice equipo esterilizado para realizar el procedimiento. Realice una incisión vertical en la piel en la porción media del músculo pectoral de aproximadamente 1 cm de largo y 2 mm del borde esternal izquierdo.
- Escupe el músculo pectoral para exponer las costillas por debajo. Evite lesiones accidentales a la embarcación. Si se produce sangrado, use aplicadores de algodón para detener el sangrado.
- Visualice las costillas e identifique los espacios intercostales observando el pulmón inflado a través de la pared torácica delgada y semitransparente. Abrir la cavidad torácica con unas tijeras quirúrgicas haciendo una incisión de 6-8 mm en el tercer espacio intercostal. Asegúrese de que la incisión esté a un mínimo de 2 mm del borde esternal donde se encuentra la arteria torácica interna.
- Inserte un pequeño espéculo de ojo de rata (ver Tabla de Materiales) en el espacio intercostal. Esto funcionará como un retractor de costillas (Figura 1A).
- Levante suavemente el pericardio con pinzas curvas y sepárelo.
- Coloque un pequeño trozo de algodón encima del pulmón y empuje suavemente hacia abajo.
4. Preparación de LAD
- La DA aparece de color rojo brillante y se extiende desde la aorta por debajo de la aurícula izquierda hacia el ápice. La posición ideal para la ligadura es aproximadamente 2 mm más baja que la punta de la aurícula izquierda. Utilice el tronco pulmonar como marcador para ayudar a identificar la aurícula izquierda y optimizar la visualización de la DA mediante la afluencia de luz (Figura 2).
- Use una aguja cónica para pasar una sutura de polipropileno 7-0 alrededor del LAD. No coloque la aguja demasiado profunda, ya que puede entrar en el ventrículo izquierdo, ni demasiado superficial, ya que puede dañar la DA.
- Retire el pequeño trozo de algodón y compruebe si el pulmón izquierdo sigue ventilado.
- Retire el retractor de costillas.
- Asegúrese de que la sutura tenga una longitud mínima de 15 cm en ambos extremos. Corta la aguja.
- Coloque un trozo de tubo de PE-50 de 1 mm sobre un trozo de tubo de PE-10 de 15 mm (consulte la tabla de materiales). Guíe ambos extremos de la sutura a través del tubo de PE-10 y desplace el tubo de PE con su extremo más grueso contra el corazón.
5. Cierre torácico y extubación
- Aplique un poco de gel de ácido fusídico en el espacio intercostal abierto y permita suavemente que el aire intratorácico restante escape obstruyendo brevemente el flujo de salida del ventilador. Se puede agregar gel de ácido fusídico adicional a la parte externa del tubo de PE para evitar la entrada de aire en el tórax.
- Cierre el músculo pectoral con una puntada X de polipropileno 5-0 por encima y por debajo del nivel del tubo de PE y asegúrese de que la parte engrosada del tubo de PE esté por debajo del nivel del músculo.
- Cierre la piel con dos puntos de polipropileno 5-0 X por encima y dos por debajo del tubo de PE (Figura 1B y Figura 3).
- Con el pecho cerrado, el animal puede volver a respirar espontáneamente. Destetar al animal del ventilador reduciendo lentamente el volumen corriente y la frecuencia respiratoria. Cuando el animal comience a respirar, desconecte espontáneamente y con cuidado el tubo del ventilador, pero manténgalo en su lugar hasta que se observe un patrón de respiración estable.
- Conecte el suministro de isoflurano con una nariz que se coloca sobre la nariz del animal y se fija en la placa base.
6. Montaje de la herramienta IR remota
- Coloque la parte lateral vertical en la placa base insertándola en las ranuras.
- Use un gancho fino para recuperar los dos extremos de la sutura y tire de ellos a través del orificio central en la parte lateral detrás del globo (consulte la Tabla de materiales).
- Guíe uno de los extremos de las suturas por encima y alrededor del globo. Siga con el otro extremo de la sutura debajo y alrededor del globo. Aplique gel de ácido fusídico para una guía más suave de la sutura.
- Guíe los extremos de la sutura a través de las ranuras en la parte superior de la parte lateral. En la parte distal de la sutura, aplique un peso de 2,1 g para mantener cada extremo de la sutura en su lugar (Figura 1C y Figura 4).
NOTA: La configuración de los pesos apropiados está sujeta a cambios y debe probarse de antemano. Consulte la Figura complementaria 1 y el Archivo complementario 1 para obtener más detalles. El diseño de la herramienta IRI remota se proporciona en la Figura complementaria 2.
7. Inducción de isquemia y reperfusión
- Inducir isquemia inflando rápidamente el balón con la bomba de balón vascular hasta 2 bar. Bloquee la bomba. Compruebe visualmente si el globo está inflado y si se han levantado las pesas (Figura 4).
- Confirme la isquemia observando el cambio en la traza del ECG.
- Dejar el globo inflado durante el tiempo establecido según el protocolo específico del estudio (30 min en los experimentos presentados).
- Detenga la oclusión simplemente desbloqueando la bomba. Desinfla el globo con cuidado. Compruebe visualmente si el globo está desinflado y se han bajado los pesos.
8. Desmontaje de la herramienta IR remota
- Corte la sutura y el tubo entre el animal y la parte lateral y retire con cuidado la parte lateral.
- Aplique gel de ácido fusídico en el sitio de inserción del tubo en el tórax. Use pinzas curvas para empujar suavemente la piel contra el tubo y use otra pinza para extraer el tubo. Corta cualquier resto de sutura cerca de la piel.
- Coloque una sutura adicional de polipropileno 5-0 para cerrar el sitio de salida del tubo y minimizar el riesgo de entrada de aire en el tórax.
9. Fin de la narcosis y recuperación
- Detenga el suministro de isoflurano y permita que el animal se despierte en un ambiente silencioso, cálido y rico en oxígeno.
- Confirme que el ratón no tiene ninguna dificultad respiratoria observándolo hasta que se recupere por completo. Proporcionar 0,3 mL de solución salina estéril (a temperatura corporal) mediante inyección intraperitoneal para prevenir la deshidratación.
- Para la analgesia postoperatoria, administrar un analgésico opioide (buprenorfina, 0,1 mg/kg) por vía subcutánea antes de que el animal pueda ambular. Revise a los ratones cada 4-6 horas durante las siguientes 24-48 horas cuando se administre buprenorfina para asegurarse de que los ratones están respondiendo a los analgésicos y para determinar si se necesitan analgésicos adicionales. El apoyo adicional debe incluir un gel o puré de dieta de cuidados de apoyo estándar recomendado que se coloque en el piso de la jaula después de la operación.
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Resultados
La validación de la capacidad de inducir isquemia se ha realizado mediante cuatro pruebas: tinción con cloruro de trifenilo tetrazolio (TTC) y Sirius Red (SR), medición de troponina I cardíaca y resonancia magnética con realce tardío de gadolinio (LGE). La significación estadística se evaluó mediante la prueba no paramétrica de Mann-Whitney, considerando el tamaño limitado de la muestra. Se atribuyó significación estadística a p < 0,05.
Los experimentos agudos (tinción con TTC, n =...
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Discusión
La novedosa técnica de oclusión remota introducida en este estudio ofrece una plataforma única para avanzar en la investigación en el campo del modelado de lesiones por isquemia-reperfusión al evitar la necesidad de manipulación directa del vaso durante la cirugía inicial y permitir la obtención simultánea de imágenes multimodales del miocardio reperfundido temprano. La caracterización exhaustiva, que incluye mediciones de troponina-I, resonancia magnética con contraste LGE, TTC y tinció...
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Divulgaciones
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.
Agradecimientos
Los experimentos se llevaron a cabo en el Centro de Imágenes Moleculares de Pequeños Animales (MoSAIC) de la KU Leuven. Los autores desean expresar su agradecimiento a Katarzyna Błażejczyk por su asistencia técnica. La investigación fue apoyada por becas de investigación de KU Leuven (C14/20/095) y la Fundación de Investigación - Flandes (FWO G0A7722N). M. Algoet cuenta con el apoyo de la Fundación de Investigación - Beca Flandes (FWO 11A2423N).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2-0 sutura de seda | Sharpoint Products | DC-2515N | |
| 5-0 sutura de polipropileno | Ethicon | 8710H | |
| 7-0 sutura de polipropileno | Ethicon | 8206H | |
| ACCLARENT Dispositivo de inflado con balón | Johnson& Johnson MedTech | BID30 | |
| Acepromazina | Kela | ||
| BD Vialon 18 g | BD | 381347 | |
| BD Vialon 20 g | BD | 381334 | |
| Betadine Solution | Purdue Pharma | 25655-41-8 | |
| Buprenorfina (inyectable Buprenex) | Reckitt Benkiser Healthcare | NDC 12496-0757-1 | |
| Carpa Zoom Styl Knijplood 2.1 g (pesos de pesca de plomo) | Visdeal.nl | ||
| Pinzas Dumont #3 | Herramientas de Ciencia Fina | 11231-30 | |
| Dumont #5 Pinzas | Herramientas de Ciencia Fina | 11251-30 | |
| Tijeras Finas Herramientas de | Ciencia Fina | 14040-10 | |
| Gel de Fucidina | Leo Pharma | ||
| Isoflurano | Abbott | NDC 5260-04-05 | |
| KD Espéculo de ojo de rata/rata | World Precision Instruments | 501897 | |
| Espéculo de ojo de rata/rata KD | World Precision Instruments | 501897 | |
| Ketamina | Dechra Fuente de | ||
| luz | Zeiss | KL 1500 LCD | |
| Sistema de resonancia magnética | Bruker BioSpin, Ettlingen, Alemania | BioSpec 70/30 | |
| NatriumChloride 0.9% | Baxter | ||
| Lámpara de calor infrarroja nocturna | Zoo Med Laboratories, Inc. | RS-75 | |
| ParaVision | Bruker BioSpin | versión 6.0.1 | |
| tubo de polietileno PE-10 | SAI Tecnologías de infusión | PE-10 | |
| tubo de polietileno PE-50 | SAI Tecnologías de infusión | PE-50 | |
| herramienta IRI remota (PMMA) | casero | ||
| Monitor quirúrgico para roedores | Instrumentos | ||
| Segmento v4.0 | Medviso, segment.heiberg.se | R12067 | |
| Secuencia de eco de gradiente autocompuertada | Bruker BioSpin, Ettlingen, Alemania | IntraGate, ParaVision 6.0.1 | |
| Portaagujas alargado delgado | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Cámara de inducción para ratón/rata Sure-Seal | World Precision Instruments | EZ-178 | |
| Conectores de tubos, polietileno, forma de Y | Westlab | 072025-0001 | |
| Catéter de dilatación Ultraverse 035 PTA: 5 mm x 40 mm, balón RBP de 17 ATM en catéter de 130 cm de largo | Bard Peripheral Vascular, Inc. | ||
| Veet (crema depilatoria) | Reckitt Benkiser Healthcare | ||
| Ventilador, MiniVent Modelo 845 | Hugo Sachs | 73-0043 | |
| Vidisic | BAUSCH & LOMB PHARMA | 685313 | |
| Xilacina | Bayer |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
