13Marcaje deC-6-glucosa asociado con LC-MS: identificación de órganos primarios de plantas en la síntesis de metabolitos secundarios

Summary

El método desarrollado de marcaje con ¹³C_6-glucosa combinado con espectrometría de masas de alta resolución por cromatografía líquida es versátil y sienta las bases para futuros estudios sobre los órganos primarios y las vías implicadas en la síntesis de metabolitos secundarios en plantas medicinales, así como la utilización integral de estos metabolitos secundarios.

Abstract

En este trabajo se presenta un método novedoso y eficiente para certificar órganos primarios implicados en la síntesis de metabolitos secundarios. Como el metabolito secundario más importante en Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) Mano. -Mzt. (PPY), la saponina de París (PS) tiene una variedad de actividades farmacológicas y la PPY tiene una demanda creciente. Este estudio estableció cuatro tratamientos de alimentación y no alimentación con hoja, rizoma y tallo vascular ¹³C_6-Glucosa para certificar con precisión los órganos primarios involucrados en la síntesis de saponinas de París VII (PS VII). Mediante la combinación de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), se calcularon de forma rápida y precisa las proporciones ¹³C/¹²C de hoja, rizoma, tallo y raíz en diferentes tratamientos, y se encontraron cuatro tipos de proporciones de picos de iones isotópicos (M^-) de PS: (M+1) ⁻/M⁻, (M+2) ⁻/M⁻, (M+3) ⁻/M⁻ y (M+4) ⁻/M⁻. Los resultados mostraron que la relación de ¹³C/¹²C en los rizomas de los tratamientos de alimentación con tallo-haz vascular y rizoma fue significativamente mayor que en el tratamiento sin alimentación. En comparación con el tratamiento sin alimentación, la proporción de moléculas de PS VII (M+2) ⁻/M⁻ en las hojas aumentó significativamente bajo los tratamientos de alimentación con hojas y haces vasculares del tallo. Simultáneamente, en comparación con el tratamiento sin alimentación, la proporción de moléculas de PS VII (M+2) ⁻/M⁻ en las hojas bajo tratamiento con rizoma no mostró diferencias significativas. Además, la proporción de moléculas de PS VII (M+2) ⁻/M⁻ en el tallo, la raíz y el rizoma no mostró diferencias entre los cuatro tratamientos. En comparación con el tratamiento sin alimentación, la proporción de la molécula de saponina Paris II (PS II) (M+2) ⁻/M⁻ en las hojas bajo el tratamiento de alimentación foliar no mostró diferencias significativas, y la relación (M+3) ⁻/M⁻ de las moléculas de PS II en las hojas bajo el tratamiento de alimentación foliar fue menor. Los datos confirmaron que el órgano principal para la síntesis de PS VII son las hojas. Sienta las bases para la futura identificación de los órganos primarios y las vías implicadas en la síntesis de metabolitos secundarios en las plantas medicinales.

Introduction

Las vías biosintéticas de los metabolitos secundarios en las plantas son intrincadas y diversas, e involucran órganos de acumulación altamente específicos y diversos¹. En la actualidad, los sitios específicos de síntesis y los órganos responsables de los metabolitos secundarios en muchas plantas medicinales no están bien definidos. Esta ambigüedad plantea un obstáculo significativo para el avance estratégico y la implementación de métodos de cultivo diseñados para optimizar tanto el rendimiento como la calidad de los materiales medicinales.

La biología molecular, la bioquímica y las técnicas de marcaje de isótopos se emplean ampliamente para desentrañar las vías de síntesis y los sitios de metabolitos secundarios en plantas medicinales 2,3,4,5, y cada una de estas metodologías exhibe fortalezas y limitaciones únicas, como diferencias en eficiencia y precisión. Los enfoques de biología molecular, por ejemplo, ofrecen una alta precisión en la identificación de los sitios dentro de las rutas biosintéticas, pero requieren mucho tiempo. Su utilidad se ve aún más limitada para las especies que carecen de secuencias genómicas disponibles públicamente, lo que hace que estas técnicas sean menos viables para estos casos⁶. Por el contrario, las técnicas de marcaje de isótopos, que emplean proporciones isotópicas como ³C/¹²C, ²H/¹H y ¹⁸O/¹⁶O, proporcionan un medio rápido y accesible para investigar los mecanismos de síntesis, transporte y almacenamiento de metabolitos secundarios ^7,8. Pueden revelar la distribución espacial de compuestos orgánicos e isótopos estables en las hojas, permitiendo así la reconstrucción de las condiciones ambientales experimentadas por las hojas a lo largo de su ciclo de vida⁹. Además, la aplicación de marcadores isotópicos externos, como ¹³C_6-Glucosa ¹⁰ y ¹³C 6-fenilalanina¹¹, permite la generación de metabolitos secundarios marcados con carbono, lo que mejora nuestra comprensión de su producción y función.

Las técnicas tradicionales de marcaje de isótopos de carbono se enfrentan a dificultades a la hora de identificar los órganos específicos responsables de la síntesis de metabolitos secundarios debido a la naturaleza altamente específica de sus vías biosintéticas y mecanismos de transporte. La cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) ha cobrado importancia como instrumento analítico fundamental en este campo, ya que ofrece un método sólido para el seguimiento de isótopos exógenos en la síntesis química de fármacos e investiga procesos in vivo como la absorción, distribución, metabolismo y excreción¹². La sensibilidad, la sencillez y la fiabilidad superiores de la LC-MS la convierten en una opción ideal para monitorizar la producción de metabolitos secundarios en las plantas¹³. En los últimos tiempos, la LC-MS se ha visto cada vez más favorecida por su aplicación en técnicas de etiquetado de isótopos externos, lo que permite evaluar la eficiencia del etiquetado en diferentes muestras. Esta metodología proporciona información crítica sobre los órganos primarios involucrados en la síntesis de metabolitos secundarios en plantas medicinales, sirviendo como un complemento invaluable a los métodos biológicos para identificar los órganos de síntesis de estos compuestos^14,15. En consecuencia, este enfoque no solo facilita la comparación de las eficiencias de etiquetado entre varios especímenes, sino que también arroja luz sobre los órganos clave implicados en la generación de metabolitos secundarios de las plantas, mejorando así nuestra comprensión de su biosíntesis.

Introdujimos un método novedoso que combina el marcaje de isótopos de carbono con la detección de LC-MS para identificar los órganos primarios responsables de sintetizar metabolitos secundarios en plantas medicinales. La saponina de París (PS) tiene una variedad de actividades farmacológicas como el anticancerígeno, la inmunomodulación y la antiinflamatoria¹⁶, y la PPY tiene una demanda cada vez mayor¹⁷. Por lo tanto, utilizamos plántulas PPY como sujetos de investigación y desciframos que las hojas son el órgano principal para sintetizar la saponina Paris VII (PS VII) (Figura 1B) mediante el uso del marcaje ¹³C_6-Glucosa asociado con el método LC-MS. Nuestro enfoque incluyó cuatro tratamientos diferentes que involucraron la alimentación con ¹³C_6-Glucosa a los haces de hojas, rizomas y troncos vasculares, así como un control sin alimentación. La elección de ¹³C_6-Glucosa es estratégica, ya que se metaboliza rápidamente en acetil coenzima A a través de la respiración, lo que facilita la síntesis de PS. Empleando la abundancia natural de ¹³C, utilizamos un sistema de espectrómetro de masas de cromatografía de gases-relación de isótopos estables (GC-IRMS) para evaluar las proporciones de ¹³C/¹²C en varios órganos de la planta y para analizar las proporciones de picos de iones isotópicos en las moléculas PS VII y Paris saponinas II (PS II) (Figura 1B). Nuestra metodología, que aprovecha ¹³precursores de metabolitos secundarios de plantas marcados con C y técnicas de espectrometría de masas de vanguardia, ofrece una alternativa más simple y precisa a los métodos convencionales de etiquetado de isótopos de carbono. Este novedoso enfoque no solo profundiza nuestra comprensión de los órganos implicados en la síntesis de metabolitos secundarios en las plantas medicinales, sino que también sienta una base sólida para futuras exploraciones de las vías biosintéticas de estos compuestos.

Protocol

1. Preparación experimental

1. Asegúrese de que durante el crecimiento de la planta, la humedad relativa del invernadero sea del 75%, las temperaturas día/noche sean de 20 °C/10 °C, el fotoperiodo se componga de 12 h de día y 12 h de noche, y la intensidad de la luz sea de 100 μmol·^m-2·^s-1. Proporcionan irradiación a través de lámparas de diodos emisores de luz (LED), manteniendo una distancia de 30 cm entre la lámpara LED y el dosel de la planta.
   NOTA: El fotoperiodo y la intensidad de la luz dependen del número de horas de sol durante el periodo de crecimiento en Yunnan. La irradiancia se mide rutinariamente mediante un sensor cuántico (ver Tabla de Materiales). Realizar los cambios necesarios en los parámetros ambientales de acuerdo con las características de la planta medicinal. Una vez que estas condiciones ambientales se han calibrado cuidadosamente en función de las características de la planta y el perfil de luz solar regional, es fundamental mantener la consistencia en estos ajustes durante toda la duración del experimento. Los cambios arbitrarios en los parámetros ambientales después de su establecimiento inicial podrían comprometer la integridad del experimento y la fiabilidad de los resultados.
2. Utilice un enfoque hidropónico¹⁸ para garantizar la precisión y especificidad de nuestro experimento. Asegúrese de que las plántulas PPY lavadas de 2 años (cosechadas en Wenshan, provincia de Yunnan (104°11′E, 23°04′N) se sumerjan en una concentración estándar de ¹/₄ de la solución nutritiva de Hoagland durante 3 días para su adaptación.
   1. Prepare la solución de nutrientes del Hoagland (consulte la Tabla de materiales) de acuerdo con las instrucciones; añadir 1,26 g de polvo de Hoagland y 0,945 g de polvo de nitrato de calcio en 4 L de agua purificada. Prepare la solución ^{de 13}C_6-glucosa (ver Tabla de Materiales) como se describe en el manual estándar; añadir 0,2 g de ^{polvo de 13}C_6-Glucosa en 100 ml de agua purificada o de solución nutritiva de Hoagland.
   2. Prepare el tanque hidropónico y la bomba de oxígeno (Figura 2; ver Tabla de Materiales).
      NOTA: En la configuración hidropónica, la utilización de una solución de ¹³C_6-Glucosa para el etiquetado evita la influencia de los microorganismos del suelo, asegurando así que la solución contribuya directamente a la rápida síntesis de metabolitos secundarios en las plantas medicinales. Para optimizar las condiciones para la absorción de ¹³C_6-Glucosa por parte de las plantas, es imperativo regular el caudal de la bomba de oxígeno entre 4 y 8 L/min. Este caudal controlado es crucial para evitar que las plántulas floten sobre la superficie del agua, lo que podría dificultar significativamente su capacidad para absorber la ¹³C_6-glucosa de manera efectiva. Mantener las plántulas sumergidas a la profundidad correcta permite una absorción eficiente del compuesto de etiquetado, lo que garantiza el éxito del proceso de síntesis de metabolitos en el sistema hidropónico.

2. Operación del experimento de etiquetado de carbono

1. Establecer cuatro tratamientos y trazar los órganos de síntesis y las vías de PS VII y PS II en PPY para demostrar que las hojas son el órgano principal para sintetizar PS.
   1. En el Tratamiento 1, la plántula PPY no se alimenta; en el Tratamiento 2, rocíe las hojas de plántula PPY con 0.2% ¹³C_6-Glucosa; en el Tratamiento 3, alimente los rizomas de las plántulas PPY con 0.2% ¹³C_6-glucosa; en el Tratamiento 3, alimente la plántula PPY en la incisión del tallo con ¹³C_6-glucosa al 0,2% (Figura 2A).
      NOTA: El tratamiento 1 se establece como un grupo de control. El tratamiento 2 está configurado para demostrar que las hojas pueden sintetizar el PS. Los tratamientos 3 y 4 están configurados para demostrar que los rizomas pueden absorber ¹³C_6-glucosa.
   2. En los tratamientos 1 y 2, cultive las plántulas PPY en una solución nutritiva normal de Hoagland. Rocíe 5 mL de solución de 0,2% ¹³C_6-Glucosa una vez por la mañana, por la tarde y por la noche sobre las hojas del Tratamiento 2.
   3. En los tratamientos 3 y 4, cultive las plántulas PPY en la solución nutritiva de Hoagland que contiene ^{0,2% de 13}C_6-glucosa. En el Tratamiento 4, use un bisturí (ver Tabla de Materiales) para cortar los tallos de las plántulas PPY desde el medio, pero mantenga los haces vasculares unidos.
   4. Deje que cada tratamiento esté etiquetado durante 3 días y cambie la solución nutritiva cada 1,5 días. Realice el experimento utilizando un diseño de bloques aleatorios y repita cada tratamiento 3 veces.
      NOTA: Al rociar las hojas, es importante colocar un papel absorbente detrás de las hojas rociadas. Esto evita que las gotas de agua caigan en la solución de nutrientes que se encuentra debajo, lo que de otro modo podría afectar los resultados del experimento. Los cortes en los tallos no se eliminan todos, sino que tienen conductos adjuntos que son visibles a simple vista.

3. Métodos de muestreo y preparación

1. Recoja hojas, tallos, rizomas y raíces de cada tratamiento por separado al final del experimento de 3 días con ¹³C_6-Glucosa. Lave bien los órganos de la planta recolectados para eliminar las impurezas de la superficie.
   NOTA: La ausencia de ^{abundancia de 13}C se puede encontrar mediante el análisis LC-MS de la solución de lavado, lo que demuestra que el lavado está limpio¹⁹.
2. Utilice un horno eléctrico de secado rápido a temperatura constante (consulte la Tabla de materiales) para secar los órganos de la planta lavados. Comience a 105 °C durante 30 minutos y luego ajuste a 60 °C hasta que el peso esté constante. Triture los órganos de la planta seca hasta convertirlos en polvo utilizando un molinillo rápido de muestras totalmente automático (consulte la tabla de materiales).
   NOTA: El polvo se utiliza para el análisis cuantitativo de las proporciones PS VII, II y ¹³C/¹²C en diferentes órganos de la planta.
3. Utilice una balanza analítica electrónica (consulte la Tabla de materiales) para pesar con precisión 30 mg de polvo para cada muestra y colóquela en 2 ml de etanol-agua al 75% v/v. Utilice un limpiador ultrasónico CNC (consulte la tabla de materiales) y realice la extracción ultrasónica a 25 °C durante 20 min (60 kHz), repita 2 veces; Fusionar las soluciones de extracción y preparar tres muestras paralelas²⁰.
   NOTA: Los errores en el peso de la muestra deben minimizarse.
4. Utilice nitrógeno para secar la solución de extracción, luego disuélvala en metanol cromatográfico hasta un volumen de 1 mL. Antes de la inyección, utilice un filtro de fase orgánica de 0,22 μm (consulte la tabla de materiales) para la filtración (figura 2B).
   NOTA: No sople el extracto cuando se seque con nitrógeno gaseoso; El extracto debe pasar a través de una membrana microporosa para garantizar que las impurezas interfieran mínimamente.

4. Configuración y funcionamiento de LC-MS

1. Configuración de MS
   1. Active la bomba de vacío colocando su interruptor en la posición de encendido. Abra la válvula principal del cilindro de gas argón y, a continuación, ajuste la válvula de presión parcial para alcanzar una presión objetivo de aproximadamente 0,3 MPa. Después de esto, asegúrese de que la válvula de gas nitrógeno también esté abierta.
   2. Inicie el software de control MS (consulte la tabla de materiales). Haga clic en la fuente de ionización de electrospray calentada (HESI Source) en el panel de software e ingrese los parámetros, incluido el voltaje capilar (3.0 kV para modo negativo), la temperatura capilar (350 °C), el caudal de gas de vaina (N₂) (35 unidades arbitrarias), el caudal de gas auxiliar (N₂) (15 unidades arbitrarias)), a través de un barrido completo basado en la masa molecular de PS (operado de m/z 100-1.500). Haga clic en el botón Aplicar para activar la fuente de iones.
      NOTA: Espere al menos 8 h para asegurar un grado de vacío suficiente para las condiciones experimentales. Verifique que la presión del gas argón y nitrógeno sea lo suficientemente alta antes del análisis.
2. Ejecución previa de LC
   1. Prepare la fase móvil A mezclando ácido fórmico al 0,1% con agua y use acetonitrilo para la fase móvil B (ver Tabla de Materiales). Desgasificar ambas fases en un sonicador de baño de ultrasonidos durante 15 minutos para eliminar los gases disueltos. A continuación, conecte la fase móvil A a su respectivo paso de fluido y haga lo mismo con la fase móvil B. Por último, mezcle una solución de metanol-agua 1:9 v/v para el líquido de limpieza y llene manualmente los frascos de la bomba y el inyector.
      NOTA: La frecuencia del sonicador de baño de ultrasonidos es de 40 kHz.
3. Establecimiento del método LC
   1. Seleccione el botón "Configuración del instrumento" para acceder a la ventana de edición de métodos.
   2. Presione el botón "Nuevo" para iniciar la creación de un nuevo método de instrumento LC-MS.
   3. Establezca el tiempo de ejecución total para el método LC. A continuación, introduzca los valores necesarios para el límite de presión, el caudal total, el gradiente de flujo, la temperatura de la muestra, la temperatura de la columna y el delta de la temperatura de preparación dentro de la ventana de edición de métodos.
      NOTA: Los ajustes del método del instrumento LC-MS se adaptan al analito de interés y al tipo de columna de cromatografía líquida utilizada. Para obtener resultados óptimos, utilice un caudal de 0,3 mL/min con una columna BEH C18 mantenida a 40 °C (consulte la tabla de materiales). La elución en gradiente se configura de la siguiente manera: comience en 10% B, aumentando linealmente a 30% B durante 8 min, luego a 45% B de 8 a 16 min, a 50% B de 16 a 24 min y a 70% B de 24 a 30 min. Inmediatamente después de esto, revierta el gradiente a la condición inicial del 10% B en 0,1 min, manteniéndolo allí durante 2,9 min adicionales. Inyecte un volumen de muestra de 5 μL para cada análisis. Los ajustes del método del instrumento LC-MS dependen de la sustancia específica que se va a analizar y del tipo de columna de cromatografía líquida utilizada²¹.
4. Adquisición de MS
   1. En la pestaña Configuración , elija el tipo de experimento MS general o MSⁿ para la configuración del método MS. Ingrese los valores necesarios para configurar el tiempo de adquisición, la polaridad (positiva o negativa), el rango de masa, el número de válvulas de desvío y la duración de la válvula de desvío. Después de ingresar estos detalles, haga clic en el botón "Guardar" para finalizar y guardar estos ajustes como un método de instrumento.
      NOTA: Los ajustes predeterminados sin columna de cromatografía son los siguientes: tiempo de adquisición, 2 min; polaridad, positiva o negativa; Rango de masa, de 100 a 1.500.
5. Realizar espectrometría de masas de múltiples etapas de acuerdo con los métodos convencionales.
   1. Emplee siempre el modo de adquisición dependiente de datos (DDA) para la recopilación de datos en espectrometría de masas de varias etapas. En el modo DDA, el espectrómetro de masas identifica los cinco iones más intensos durante cada escaneo en la primera etapa de la MS en tándem, que posteriormente se fragmentan y se examinan en la segunda etapa de la espectrometría de masas en tándem.
      NOTA: Los datos recopilados de MS y MS/MS se pueden utilizar para el análisis posterior y la búsqueda en bases de datos.

5. Adquisición, análisis y cálculo manual de datos

1. Adquisición y análisis de datos
   1. Haga doble clic en los archivos sin procesar para abrir todos los espectros de masas de MS. Calcule manualmente los valores de diferencia m/z entre el ion y los iones de fragmento correspondientes.
   2. Importe los archivos de datos sin procesar de los tratamientos de control y muestras y los blancos en el software de análisis de espectrometría de masas para identificar los PS calculando con precisión la masa y los fragmentos de PS.
      NOTA: PS VII y PS II se identifican por comparación con los tiempos de retención y la coelución de soluciones estándar auténticas. LC-MS detecta una serie de pequeños picos en las posiciones de los picos de iones moleculares. La relación de cada serie de picos de iones isotópicos es constante. Cuando se dan isótopos exógenos ^{de 13}C, la abundancia total de ¹³C en la planta aumenta y las proporciones de la serie de picos de iones isótopos de los metabolitos secundarios de la planta cambian. La tolerancia máxima de error de masa se establece en 5 ppm.
   3. Escanee el rango de masa m/z 500-1.500 para identificar el pico básico. Determine el peso molecular preciso con 4 decimales, de acuerdo con el peso molecular preciso y el tiempo de retención de la molécula objetivo. Busque el área máxima del flujo de iones isótopos en serie y derive los valores de M^-, (M+1) ^-, (M+ ^2)-, (M+ ^3)-, (M+4) ^-. Cuando la fase móvil contiene ácido fórmico, los iones negativos también incluyen (M + COOH) ⁻, (M + COOH + 1) ⁻, (M + COOH + 2) ⁻, (M + COOH + 3) ⁻ y (M + COOH + 4) ⁻.
      NOTA: La selección de picos dentro del rango de masa m/z 500-1.500 mejora la precisión de la identificación de picos de iones moleculares para PS VII y PS II. Por ejemplo, el espectro de masa de iones negativos de PS VII (C₅₁H₈₂O₂₁, 1030.5349) se ioniza principalmente con iones ^COOH− en una mezcla de ácido fórmico y agua. Los iones isótopos en serie observados incluyen 1029.53⁻, 1030.54⁻, 1031.54⁻, 1032.55⁻, 1033.55⁻, y se extienden hasta 1079.56−.
2. Cálculo de datos
   1. Para reducir el efecto de la abundancia natural de ¹³C, calcule las proporciones de corrientes iónicas marcadas y no marcadas para cada órgano bajo diferentes tratamientos, centrándose específicamente en las relaciones (M+1)^-/ M^-, (M+2)^-/M^-, (M+3)^-/ ^M-y (M+4)^-/ M^-. Para diferenciar entre isótopos marcados y naturales para una evaluación precisa de la incorporación de ¹³C, calcule estas proporciones para n = 1, 2, 3, 4 utilizando la ecuación (1).
      Relación = A (M+2) ⁻/ ^AM− (1)
      PD: (M+2) ⁻ incluye (M+2+COOH) ⁻ y (M+2) ⁻; M⁻ incluyen (M+COOH) ^- y M⁻.
      NOTA: Aquí, M^- se refiere a las áreas máximas combinadas de las corrientes iónicas para (M + COOH) ⁻ y M ⁻, principalmente ionizadas con COOH⁻ en ácido fórmico-agua. A representa el área del pico. Por ejemplo, las fórmulas para calcular las proporciones PS VII se ilustran de la siguiente manera:
      Relación+1= (A1030.54+A1076.55)/(A1029.53+A1075.55)
      Relación+2= (A1031.54+A1077.55)/(A1029.53+A1075.55)
      Relación+3= (A1032.55+A1078.56)/(A1029.53+A1075.55)
      Relación+4= (A1033.55+A1079.56)/(A1029.53+A1075.55)

Results

Para confirmar que el_{suministro de} ¹³C6-glucosa en los rizomas fue exitoso, analizamos más a fondo las proporciones de isótopos ^{de 13}C/¹²C en los rizomas. Las proporciones de isótopos ¹³C/¹²C de los tratamientos 3 y 4 fueron mucho más altas que las del tratamiento 2 (Figura 1A). Los resultados indicaron que ^{la 13}_C6-Glucosa del Tratamiento 3 y 4 ingresó a los rizomas a través de la ingestión.

Las proporciones de los picos de isótopos de ¹³C, como (M+1) ⁻/M⁻, (M+2) ⁻/M⁻, (M+3) ⁻/M⁻ y (M+4) ⁻/M⁻, suelen permanecer constantes. Los compuestos marcados con ¹³C añadido exógenamente tienen la misma estructura molecular, pesos moleculares, propiedades fisicoquímicas y tiempos de retención similares a los de sus homólogos no marcados. Sin embargo, cuando estos compuestos marcados se analizaron mediante espectrometría de masas, las proporciones de su pico de iones isotópicos cambiaron. En nuestro estudio, utilizamos LC-MS para detectar PS VII y PS II en cuatro órganos diferentes de PPY en varios tratamientos (Figura 3). En comparación con el Tratamiento 1, los resultados indicaron un aumento significativo en la relación de PS VII (M+2) ⁻/M⁻ en las hojas del PPY tratadas con ¹³C exógeno (Figura 3B). Particularmente en el Tratamiento 2, donde las hojas de PPY se rociaron con ¹³C_6-Glucosa, se sintetizaron PS VII marcadas con dos átomos de ¹³C. Sin embargo, en el Tratamiento 4, la proporción de moléculas de PS VII (M+2) ⁻/M⁻ en las hojas no tuvo diferencia significativa entre el rizoma y el tratamiento no alimenticio, y las proporciones de las moléculas de PS VII (M+1) ⁻/M⁻, (M+3) ⁻/M⁻, (M+4) ⁻/M⁻ en tallo, rizoma y raíz en los cuatro tratamientos no mostraron diferencias significativas (Figura 3A, C,D). Además, la proporción de moléculas de PS II (M+2) ⁻/M⁻ aumentó lentamente en el Tratamiento 2 (Figura 3F). No hubo diferencias notables en las proporciones de las moléculas de PS II (M+1) ⁻/M⁻ y (M+4) ⁻/M⁻ en hojas entre los Tratamientos 1 y 2 (Figura 3E, H), mientras que la proporción de moléculas de PS II (M+3) ⁻/M⁻ mostró una disminución notable en las hojas en el Tratamiento 2 en comparación con el Tratamiento 1 (Figura 3G). Estos hallazgos sugieren que la síntesis de PS VII ocurre efectivamente en las hojas tratadas con ¹³C_6-glucosa, alineándose con la ruta biosintética conocida de los PS.

Nuestro enfoque sugiere que la hoja es el órgano primario para la síntesis de PS VII en PPY, en contraste con la síntesis de PS II. En particular, la PS VII marcada con ¹³C estuvo ausente en el rizoma después del tratamiento de las hojas con ¹³C_6-glucosa, lo que implica un transporte lento de PS VII de las hojas a los rizomas. Por el contrario, se detectaron ¹³PS II marcados con C en el rizoma después de los tratamientos de marcaje de rizoma, lo que indica una posible síntesis de rizoma en esta etapa y requiere una mayor exploración de las ubicaciones de síntesis de PS II. La detección exclusiva de la relación (M+2) ⁻/M⁻ para las moléculas de PS VII en las hojas se alinea con el destino metabólico de la ¹³C_6-glucosa; después de la absorción, se metaboliza a través de la glucólisis para producir acetil-CoA con dos isótopos ¹³C. Considerando el PS como un compuesto isoprenoide, su biosíntesis a partir de acetil-CoA se realiza a través de la vía del ácido mevalónico (MVA) o de la vía 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato (MEP) (Figura 4), lo que conduce a la formación de (M+2) ⁻/M⁻ PS VII. Así, nuestro estudio delinea a la hoja como el órgano definitivo para la síntesis de PS VII en PPY.

Figura 1: La proporción de isótopos ¹³C / ¹²C en rizomas de cuatro tratamientos. (A) Las proporciones de ^{isótopos 13}C / ¹²C en los rizomas de los tratamientos 4 y 3 fueron mucho más altas que las de los tratamientos 1 y 2, lo que indica que ¹³C_6-glucosa había ingresado significativamente a los rizomas a través de la alimentación de raíces. Cada columna representa la media (± SE) de tres réplicas. Las letras de las columnas significan significativamente diferente en la relación de isótopo ¹³C/¹²C en cuatro tratamientos (p < 0,05). Abreviatura: PS = saponinas de París . (B) La espectrometría de masas de alta resolución de PS VII (C₅₁H₈₂O₂₁, 1030.5349) detectó su ion negativo con un tiempo de retención de 16,83 minutos. Debido a la abundancia natural de ¹³C (con un peso molecular exacto de 13.003, en comparación con ¹²C a 12.000), una gama de picos de isótopos que incluyen (M^-), principalmente (M+1)^-, (M+2)^-, (M+3)^- y (M+4)^-, aparecen en el mismo tiempo de retención que el pico del ion molecular PS VII M^-. Estos picos se debieron principalmente a la ionización ^del COOH en el agua con ácido fórmico. Un diagrama de barras ampliado resalta estos picos de isótopos. Se calcularon las relaciones de corriente iónica de (M+1)⁻/M⁻, (M+2)⁻/M⁻, (M+3)⁻/M⁻ y (M+4)⁻/M⁻ . Al analizar los cambios en estas proporciones, pudimos rastrear e inferir la biosíntesis de saponinas. Aquí, M^- representó las áreas de pico combinadas de la corriente iónica para (M + COOH^{) y} M^-. La Figura 1B fue modificada de Wen et ^al.24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: ¹³C_6-Flujo de trabajo de etiquetado e integración de datos. Las plántulas se marcaron mediante aspersión y alimentación con ¹³_C6-glucosa al 0,2% durante 3 días; luego, los extractos de cada órgano se analizaron isotópicamente por LC/MS y GC/IRMS y se combinaron con la integración de picos y los datos para el análisis específico de órganos de la síntesis de PS. (A) Un diagrama esquemático que ilustra la alimentación de glucosa en diferentes órganos. Los tratamientos 1-4 fueron sin alimentación, alimentados en hoja, tallo-haz vascular y rizoma, respectivamente. (B) Los pasos para el análisis LC-MS del líquido extraído hecho del tejido PPY seco a través de un instrumento de molienda y soplado de nitrógeno. Abreviaturas: LC/MS = cromatografía líquida-espectrometría de masas; PPY = Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) Mano. -Mzt.; PS = saponina de París. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Seguimiento de la saponina VII de París y la biosíntesis de la saponina II de París a través de la alimentación con ¹³C_6-glucosa de órganos vegetales. (A-D) La proporción de moléculas de PS VII (M+1) ⁻/M⁻, (M+2) ⁻/M⁻, (M+3) ⁻/M⁻, (M+4) ⁻/M⁻ en cada órgano de los cuatro tratamientos. La proporción de moléculas de PS VII (M+2) ⁻/M⁻ aumentó significativamente en las hojas del Tratamiento 2 y del Tratamiento 3. En el tallo, la raíz y el rizoma, la relación de las moléculas de PS VII (M+2) ⁻/M⁻ no mostró diferencias evidentes entre los cuatro tratamientos. (E-H) La proporción de moléculas de PS VII (M+1) ⁻/M⁻, (M+2) ⁻/M⁻, (M+3) ⁻/M⁻, (M+4) ⁻/M⁻ en cada órgano de los cuatro tratamientos. En comparación con el Tratamiento 1, las proporciones de moléculas de PS II (M+2) ⁻/ M⁻ en las hojas no tuvieron diferencia con el Tratamiento 2. En el Tratamiento 2, la proporción de moléculas de PS II (M+1) ⁻/M⁻ y (M+4) ⁻/M⁻ no tiene diferencias evidentes en las hojas en comparación con el Tratamiento 1. Las proporciones de moléculas de PS II (M+3) ⁻/M⁻ han disminuido en las hojas en comparación con el Tratamiento 1. París saponina VII, PS VII. Cada columna representa la media (± SE) de tres réplicas. "*" indicó una diferencia significativa con respecto al tratamiento sin alimentación (prueba t a p < 0,01). Abreviatura: PS = saponinas de París . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Descripción de la PS VII generada por la ¹³_C6-glucosa exógena que entra en la vía de la AMEU. Diagrama esquemático del metabolismo de la acetil coenzima A marcada con ¹³C_6-Glucosa para generar moléculas de PS VII (M+2) ⁻/M⁻ a través de la vía MVA. El carbono etiquetado se muestra en rojo; El carbono sin etiquetar es gris. Bajo la acción de la glucólisis, la ¹³C_6-glucosa se escinde en dos moléculas de acetil coenzima A (M + 2)-, que luego genera pirofosfato de isopentenilo y pirofosfato de dimetilpropenil a través de la vía MVA, y luego genera atenol cíclico a través de la generación catalítica de geranilgeranil pirofosfato sintasa, farnesil pirofosfato sintasa, escualeno sintasa, escualeno epoxigenasa, cicloatenol sintasa cicloartenol, luego oxidación, descarboxilación, reducción y otras reacciones para obtener colesterol, colesterol a través de una serie de enzimas del citocromo P450, glicosiltransferasas y furostanoide saponina 26-O-β-glucosidasa de la modificación tardía de la formación de moléculas de PS VII que contienen dos carbonos marcados. (M+2) ^- indica que el COOH- de dos carbonos está ionizado en este punto, y el número de etiquetas para dos carbonos se puede derivar usando (M+2) ⁻/M⁻. Utilizando protocolos estándar, el cuerpo isotópico se identifica individualmente y las corrientes iónicas se dividen para obtener datos de etiquetado para los isótopos. El valor de M^- es estable. Abreviatura: PS = saponinas de París; PS VII = saponina de París VII; MVA = Vía del mevalonato; GPPS = geranilgeranil pirofosfato sintasa; FPPS = Farnesil pirofosfato sintasa; SQS = Escualeno sintasa; SQE = Escualeno epoxigenasa; CYPs = enzimas del citocromo P450; UGTs = Glucurónica transferasa; F26G = saponina furostanoide 26-O-β-glucosidasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

La implementación exitosa de este protocolo depende de una investigación exhaustiva sobre las propiedades fisiológicas, los tejidos, los órganos y los metabolitos secundarios de las plantas. El enfoque de diseño experimental descrito en el protocolo establece una base sólida para investigar las vías biosintéticas de los metabolitos secundarios de las plantas. Los factores críticos en este experimento son (1) determinar la edad de las plántulas perennes y (2) elegir el momento correcto de detección de marcadores de isótopos. Las plantas medicinales se clasifican en perennes y anuales, cada una con diferentes patrones de síntesis y acumulación de metabolitos secundarios. Este experimento tiene como objetivo esclarecer los órganos sintéticos primarios de metabolitos secundarios en plantas medicinales mediante el análisis de la tasa de síntesis de estos metabolitos. Por lo tanto, es esencial seleccionar cuidadosamente los años y etapas de crecimiento que corresponden a estos patrones y tasas de síntesis.

El PPY es una planta medicinal perenne, y el contenido de PS se acumula año tras año. Sin embargo, se demostró que la tasa de síntesis de PS no difiere de la del PPY²² de las plantas perennes. Al mismo tiempo, el tamaño más pequeño de las plántulas de 2 años en comparación con las mayores facilita la hidroponía. Por lo tanto, este estudio utilizó plántulas PPY de 2 años. Esto asegura que las plantas seleccionadas exhiban la tasa más alta de síntesis de metabolitos secundarios. Es crucial reconocer la variación en las tasas de síntesis y transporte de metabolitos secundarios entre diferentes especies²³. La duración óptima para el período de etiquetado-detección está determinada por estas tasas. Las investigaciones indican que el contenido de azúcar y PS en las hojas de PPY disminuye en 3 días²⁴, lo que sugiere un proceso de transporte lento para el PS debido a su peso molecular sustancial, que es poco probable que se complete dentro de este período de tiempo. Una duración del tratamiento inferior a unas pocas horas puede conducir a una síntesis inadecuada y a dificultades de detección para el PS ^5,25 marcado. Por el contrario, si se prolonga el tratamiento más allá de 3 días, se corre el riesgo de trasladar el PS de las hojas al rizoma, lo que podría distorsionar los resultados experimentales. Por lo tanto, se selecciona un período de etiquetado intermedio de 3 días para minimizar la interferencia de órganos, particularmente para los métodos de rociado de hojas y etiquetado de rizomas, lo que garantiza resultados experimentales más precisos.

Estudios previos de marcaje de isótopos en Nicotiana tabacum^26,27 y Brassica napus²⁸ habían demostrado una absorción e integración exitosa de ¹³C_6-glucosa en los tejidos vegetales. En nuestra investigación, nos centramos en plántulas PPY de 2 años de edad cultivadas hidropónicamente, implementando tratamientos de alimentación con ¹³C_6-Glucosa para hojas, rizomas y haces vasculares del tallo, junto con tratamientos de control no alimentarios. Utilizando la detección de LC-MS, encontramos que al tercer día después del etiquetado, la proporción de ¹³C/¹²C en los rizomas de los tratamientos de alimentación con tallo-haz vascular y rizoma era significativamente mayor que en los controles sin alimentación, lo que confirma la asimilación efectiva de ¹³C_6-glucosa y el éxito de nuestro enfoque de etiquetado (Figura 2). En nuestro estudio, analizamos simultáneamente cuatro tipos de proporciones de picos de iones isotópicos para moléculas PS VII y PS II en cuatro órganos diferentes de PPY: (M+1) ⁻/M⁻, (M+2) ⁻/M⁻, (M+3) ⁻/M⁻ y (M+4) ⁻/M⁻. Es importante destacar que observamos que en el tratamiento de marcaje foliar, las proporciones de la molécula PS VII (M+2) ⁻/M⁻ en hojas fueron notablemente mayores que en el tratamiento no alimenticio. La proporción de moléculas de PS VII (M+2) ⁻/M⁻ en las hojas bajo el rizoma y el tratamiento no alimentario no presenta diferencias (Figura 3B). Además, en comparación con el tratamiento sin alimentación, la proporción de la molécula de saponinas Paris II (PS II) (M+2) ⁻/M⁻ en las hojas bajo el tratamiento de alimentación foliar sin diferencia significativa, y las proporciones de las moléculas PS II (M+3) ⁻/M⁻ en las hojas bajo el tratamiento de alimentación foliar fueron menores (Figura 3G). Los tratamientos de marcaje de tallo-haz vascular y rizoma mostraron diferencias significativas en las proporciones de moléculas de PS II (M+1) ⁻/M⁻ y (M+4) ⁻/M⁻ en rizomas en comparación con el tratamiento no alimentado (Figura 3E, H).

Al adaptar este enfoque a otras plantas medicinales, es crucial seleccionar compuestos marcadores adaptados a los precursores de los metabolitos secundarios primarios de la planta, asegurando la especificidad del marcador. Si el compuesto objetivo se sintetiza principalmente en el tallo, el compuesto de marcaje debe ser capaz de ser transportado y metabolizado eficientemente en el tallo. Vuelva a evaluar la vía de síntesis si no existen las proporciones isotópicas esperadas, como (M+2) ⁻/M⁻ para PS VII, lo que confirma la idoneidad de los compuestos de marcaje. Es posible que sea necesario ajustar la concentración del compuesto marcador en la solución nutritiva para garantizar una absorción e integración adecuadas en los compuestos objetivo dentro del órgano deseado. Los parámetros de detección de LC-MS pueden requerir optimización para detectar los metabolitos marcados específicos de interés de manera efectiva. Esto podría implicar el ajuste de la configuración de la espectrometría de masas, como el modo de ionización, para mejorar la sensibilidad y la especificidad de los compuestos exclusivos de la especie vegetal y el órgano objeto de investigación. Si las proporciones ^{de 13}C/¹²C no se detectan en los rizomas de los tratamientos de marcaje de tallo-haz vascular y rizoma, la concentración de ¹³_C6-glucosa en la solución nutritiva de Hoagland y la duración del etiquetado deben aumentarse hasta que se pueda lograr la detección. ^{Los métodos}de alimentación y las técnicas analíticas establecidas en este estudio deben guiar el análisis y la interpretación de los resultados para la identificación de los órganos de síntesis de metabolitos secundarios en diversas plantas medicinales.

Los tratamientos de alimentación y no alimentación con ¹³C_6-glucosa para hojas, rizomas y haces vasculares del tallo en este experimento ofrecen una mayor especificidad en la identificación de los órganos de síntesis de metabolitos secundarios en comparación con los métodos tradicionales de marcaje de isótopos de carbono. No obstante, persisten los desafíos. Una limitación clave es la ausencia de un marco de tiempo de detección de etiquetado único para todas las plantas medicinales. La selección de un período de tiempo óptimo mejora la eficacia del etiquetado. Además, el uso de proporciones para analizar los resultados complica la diferenciación de las ubicaciones de los grupos funcionales en isómeros grandes y complejos. Por lo tanto, se recomienda una revisión exhaustiva de la literatura y experimentos preliminares antes de emplear esta metodología. Esta estrategia no solo garantiza la precisión y la eficiencia, sino que también tiene implicaciones significativas para la biología y la farmacología de las plantas. La integración de este método con la espectroscopia de resonancia magnética nuclear, una técnica líder para el análisis de estructuras de compuestos orgánicos, permite la identificación precisa de las ubicaciones de etiquetado de ¹³C. Este método allana el camino para explorar las rutas biosintéticas de los metabolitos secundarios de las plantas, presentando un enfoque detallado y eficaz para determinar la especificidad de los órganos en la síntesis de metabolitos secundarios en plantas medicinales.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1 % Agua de ácido fórmico	Fábrica de reactivos químicos de Chengdu Kelong	44890
13C6-Glucosa en polvo	MERCK	110187-42-3
Acetonitrilo	Chengdu Kelong Fábrica de reactivos químicos	44890
VIALES DE MUESTREADOR AUTOMÁTICO	Biosharp Biotechnology Company	44866
BEH C18 columna	Waters,Milfor,MA	1.7μ m,2.1 * 100 mm
Limpiador ultrasónico CNC	Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd	KQ-600DE
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific, Fremont,CA	3
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific,Fremont,CA	3
Horno		DHG-9146A
Balanza analítica electrónica	Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd	SOP
Etanol	Fábrica de reactivos químicos de Chengdu Kelong	44955
Molino rápido de muestras completamente automático	Tecnología Shanghai Jingxin Tecnología	Tissuelyser-48
Cromatografía de gases-Espectrómetro de masas de relación de isótopos estables	Thermo Fisher	Delta V Advantage
Solución de Hoagland	Sigma-Aldrich	H2295-1L
Tanque hidropónico	JRD	1020421
Software Isodat	Thermo Fisher Scientific	3
Cromatografía líquida espectrometría de masas de alta resolución	Agilent Technology	Agilent 1260 -6120
Instrumento de fabricación de nitrógeno	PEAK SCIENTIFIC	Genius SQ 24
Filtro de fase orgánica	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	44890
Bomba de oxígeno	Magic Dragon	MFL
Sensor cuántico	Highpoint	UPRtek
Bisturí	Handskit	11-23
Aspersión puede	CHUSHI	WJ-001
Xcalibur  software	Thermo Fisher Scientific	4.2