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Artículo de método

Aislamiento de médula ósea de ratón neonatal y preparación de macrófagos derivados de la médula ósea

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DOI:

10.3791/66613

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24 de mayo de 2024

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine, 2Vaccine Development Center, West Virginia University Health Sciences Center

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un método sencillo y no enzimático para aislar células de médula ósea de ratón neonatal de 7-9 días de edad y generar macrófagos diferenciados utilizando un sobrenadante de células L929 como fuente de factor estimulante de colonias de granulocitos (M-CSF). Los macrófagos derivados de la médula ósea se analizaron más a fondo para determinar los antígenos de superficie F4/80, CD206, CD11b y la competencia funcional.

Resumen

Varias técnicas para aislar la médula ósea de ratones adultos han sido bien establecidas. Sin embargo, aislar la médula ósea de ratones neonatos es un desafío y requiere mucho tiempo, pero para algunos modelos, es traslacionalmente relevante y necesario. Este protocolo describe un método eficiente y sencillo para preparar células de médula ósea de cachorros de 7 a 9 días de edad. Estas células se pueden aislar o diferenciar aún más en tipos específicos de células de interés. Los macrófagos son células inmunitarias cruciales que desempeñan un papel importante en la inflamación y la infección. Durante el desarrollo, los macrófagos neonatales contribuyen significativamente a la remodelación de los tejidos. Además, el fenotipo y las funciones de los macrófagos neonatales difieren de los de sus homólogos adultos. Este protocolo también describe la diferenciación de los macrófagos neonatales de las células aisladas de la médula ósea en presencia de medio condicionado con L929. Los marcadores de superficie para macrófagos neonatales diferenciados se evaluaron mediante análisis de citometría de flujo. Para demostrar la funcionalidad, también se probó la eficiencia fagocítica utilizando Escherichia coli conjugada con colorante sensible al pH.

Introducción

La médula ósea encierra poblaciones de células madre hematopoyéticas y mesenquimales que son autorrenovables y se pueden diferenciar en varios linajes celulares. Las células madre hematopoyéticas de la médula ósea dan lugar a linajes mieloides y linfoides1. Las células madre mesenquimales producen osteoblastos (hueso), adipocitos (grasa) o condrocitos (cartílago)2. Estas células tienen múltiples aplicaciones en el campo de la biología celular y la ingeniería de tejidos, incluida la terapia génica 3,4. Las células progenitoras presentes en la médula ósea se diferencian en tipos celulares específicos en presencia de factores de crecimiento específicos del linaje. La eritropoyetina promueve la proliferación de células progenitoras eritroides, el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) estimula el crecimiento de colonias de neutrófilos y la trombopoyetina regula la producción de plaquetas, como algunos ejemplos de factores de crecimiento específicos del linaje5. El FACS marcado con antígeno de superficie celular y la clasificación celular activada magnéticamente (MACS) son métodos bien establecidos para el aislamiento y la purificación de los tipos específicos de células derivadas de la médula ósea6.

Aunque los estudios neonatales están avanzando hacia la búsqueda de las causas de las muertes neonatales y el tratamiento de las complicaciones durante los partos prematuros, el desarrollo terapéutico directo sigue siendo una necesidad médica insatisfecha. Smith y Davis afirmaron: "Los pacientes pediátricos siguen siendo huérfanos terapéuticos"7. Existen varios desafíos, como muestras pequeñas, efectos de por vida del resultado y cuestiones éticas en la obtención del consentimiento en los estudios clínicos de neonatos8. Por lo tanto, existe una gran demanda de modelos de estudio in vivo e in vitro específicos para neonatos para lograr relevancia traslacional. Debido a las similitudes entre los niveles anatómicos y tisulares, los períodos de gestación cortos y el tamaño de las camadas, los roedores son el sistema modelo de mamíferos más estudiado.

Aquí, describimos un procedimiento detallado, altamente factible y reproducible para aislar médula ósea de crías de ratón de 7-9 días de edad y su capacidad para diferenciarse en macrófagos. Sin embargo, se podría lograr una variedad de linajes celulares con el uso de señales de diferenciación distintas. También demostramos la presencia de marcadores de superficie celular y la presencia de actividad fagocítica in vitro esperada para los macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM).

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Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de Virginia Occidental y se realizaron siguiendo las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Nacional de Investigación. Para este estudio se utilizaron crías de ratón C57BL/6J. Los detalles de todos los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de los medios

  1. Prepare 3 mL de medio de cultivo MEM suplementado con 10% de FBS, 2 mM de glutamina, 25 mM de HEPES y penicilina (100 U/mL)/estreptomicina (100 μg/mL) en un tubo de centrífuga de 5 mL, y manténgalo en hielo.
  2. Si es necesario almacenar los progenitores de la médula ósea en nitrógeno líquido, prepare medios de congelación que contengan 10% de DMEM, 80% de FBS y 10% de DMSO.
  3. Para obtener DMEM completo, prepare DMEM suplementado con 10% de FBS, 2 mM de glutamina, 25 mM de HEPES y penicilina (100 U/mL)/estreptomicina (100 μg/mL).
  4. Para la diferenciación de macrófagos, prepare DMEM suplementado con 10% de FBS, 2 mM de glutamina, penicilina (100 U/mL)/estreptomicina (100 μg/mL) y sobrenadante de células L929 al 10% 9,10,11.

2. Preparación del sobrenadante de células L929

  1. Descongele las células L929 almacenadas en nitrógeno líquido y transfiéralas a un tubo de centrífuga de 15 ml que contenga 5 ml de DMEM completo. Centrifugar a 350 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
  2. Vuelva a suspender las células en 5 mL de medio DMEM completo y siembrójelas en un matraz de cultivo de tejidos T25 a una densidad de 2×105 células. Cuente las celdas con un contador de células automatizado usando azul de tripán al 0,4%. Incubar a 37 °C con 5% de CO2 hasta alcanzar el 70% de confluencia.
  3. Para separar las células, primero lávelas con 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Aspire el PBS y reemplácelo con 2,5 mL de tripsina-EDTA al 0,05%.
  4. Incubar a 37 °C con 5% de CO2 durante 5 min y añadir 5 mL de DMEM completo.
  5. Recoja las células y centrifugue a 350 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
  6. Vuelva a suspender el pellet de celda en 15 mL de medio DMEM completo y transfiéralo a un matraz T75.
  7. Incubar a 37 °C con 5% de CO2 hasta que las células alcancen el 90% de confluencia, y luego recoger el medio y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Filtre el medio que contiene M-CSF a través de un filtro de 0,45 μm y congele a -80 °C en alícuotas de 5 mL.

3. Preparación animal

  1. Bajo un gabinete de bioseguridad, separe cuidadosamente a los cachorros de ratón C57BL/6J de 7-9 días de edad (una camada de 6 cachorros) de la madre y colóquelos en una jaula separada.
  2. Remoje una bola de algodón en 2 ml de isoflurano de grado veterinario en un frasco de campana u otra cámara de contención.
  3. Coloque un cachorro en la cámara y cierre la tapa. Monitoree al neonato durante aproximadamente 90 s para asegurarse de que se quede inmóvil e inconsciente.
  4. Retire rápidamente al cachorro y decapitánelo con tijeras afiladas (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente) antes de que el cachorro pueda recuperar la conciencia.
    NOTA: Los neonatos no respiran lo suficientemente profundo como para la eutanasia solo por inhalación de isoflurano.
  5. Asegúrese de cerrar la tapa del recipiente después de retirar cada cachorro. La misma bola de algodón se puede usar para 5-7 cachorros.

4. Aislamiento de la médula ósea neonatal

  1. Esterilizar el cuerpo del neonato con etanol al 70%.
  2. "Con fórceps y tijeras quirúrgicas de punta fina, haga una incisión entre el
    abdomen y patas traseras. Retire la piel tirando hacia el pie de las extremidades traseras.
  3. Raspe el tejido conectivo y el músculo adherido a los huesos con pinzas de bordes afilados.
  4. Corte la tibia y el fémur, como se muestra en la Figura 1, con unas tijeras para separar y quitar. Con fórceps, coloque estos huesos en el tubo de medios sobre hielo. Repite el proceso para cada cachorro.
  5. Transfiera los huesos con la ayuda de pinzas a un colador de 40 μm con un tubo de recolección. Triture los huesos y libere la médula presionando con un émbolo de jeringa de 3 ml contra el colador.
  6. Centrifugar la suspensión celular a 350 x g durante 5 min a 4 °C.
  7. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células mediante un pipeteo suave en NaCl al 0,2%, una solución hipotónica para la lisis de los eritrocitos. Agregue inmediatamente un volumen igual de 1.6% de NaCl para llevar la solución a isotónico.
  8. Centrifugar a 350 x g durante 5 min a 4 °C y retirar la solución de lisis.
  9. Vuelva a suspender en DMEM completo para uso inmediato o medios de congelación para almacenamiento y cuente las células utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
    NOTA: Para el presente estudio, este método produjo 6,55 (± 1,44) × 106 células de médula ósea/pup (Figura 1E).
  10. Almacene las células a -80 °C en medios de congelación o utilícelas inmediatamente como se describe a continuación.
    NOTA: Debido a la edad, los huesos son transparentes y lo suficientemente claros como para visualizar la médula a través de ellos. Es importante tener cuidado al tirar de los huesos, ya que la aplicación de una ligera presión sobre ellos puede ser suficiente para liberar la médula. La médula ósea de los huesos neonatales se encuentra en forma de líquido en lugar de un hilo intacto que se encuentra en los huesos adultos. Es difícil recoger la médula si se escapa durante la recogida de los huesos.

5. Diferenciación de macrófagos derivados de la médula ósea neonatal

  1. Siembre 2 × 107 células de médula ósea por matraz T75 en 10 mL de DMEM completo que contiene un 10% de sobrenadante de células L929 (2,5 mL) como fuente de M-CSF. Incubar las placas de cultivo a 37 °C con 5% de CO2 durante 5 días. Agregue 2 mL de medios acondicionados con L929 en el día 3 de diferenciación.
  2. Observe las células bajo el microscopio diariamente utilizando un microscopio invertido y un sistema de imágenes con un aumento de 20x. Tras la diferenciación, los macrófagos deben aparecer adherentes, alargados y heterogéneos (Figura 2).
  3. Para recolectar los macrófagos para ensayos posteriores, aspire los medios de diferenciación.
  4. Lave las células con 5 mL de PBS para eliminar las células no adherentes y las proteínas séricas que interferirán con el desprendimiento. Aspirar el PBS.
  5. Recolectar las células añadiendo 5 mL de tripsina-EDTA al 0,05% al matraz. Coloque el matraz de cultivo a 37 °C con una incubadora de CO2 al 5% durante 5 min y añada 5 mL de DMEM.
  6. Pipetear las células a separar y centrifugar a 350 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
  7. Disociar el pellet de la célula en 1 mL de DMEM completo, y contar y comprobar la viabilidad de la célula utilizando azul de tripán. Las BMDM aisladas mediante este método son 7,05 (± 2,52) ×105 células/cría (Figura 1E).
    NOTA: Observe la presencia de células fusiformes que comienzan a aparecer en el segundo día de diferenciación (Figura 1B, flechas rojas). Si el color de los medios se vuelve amarillo, lo que indica que se ha gastado, agregue más medios condicionados por L929 en el día 4 de diferenciación; No se recomienda el reemplazo completo de los medios.

6. Inmunomarcaje y análisis de citometría de flujo

  1. Bloquee el marcaje de anticuerpos no específicos de los BMDM (2x105/etiqueta) mediante el tratamiento con 10 μL/107 células de reactivo bloqueante FcR según las recomendaciones del fabricante en un volumen de tampón de citometría de flujo de 100 μL/etiqueta (PBS suplementado con 2 mM de EDTA y 0,5% de albúmina sérica bovina). Mantener en hielo durante 10 min.
    NOTA: Las celdas se pueden bloquear a granel o en pocillos o tubos individuales. Todos los pasos posteriores indican cantidades y volúmenes por etiqueta de marcador celular individual a un volumen final de 100 μL.
  2. Lave las células añadiendo 200 μL de tampón de citometría de flujo y centrifugar a 525 x g durante 7 min a temperatura ambiente.
  3. Retire el sobrenadante y siembre las células en una placa de 96 pocillos con fondo en U a una densidad de 5 × 105 células por pocillo. Tiña las células añadiendo FVS780-Colorante de recuento de células vivas/muertas diluido a 3.000 veces y 0,625 μL de BV786-CD11b, PE-F4/80 y AlexaFluor488-CD206 en 100 μL de tampón de citometría de flujo, ya sea individualmente o en combinación 12,13,14,15. Incubar las células durante 45 minutos sobre hielo cubierto con papel de aluminio.
  4. Añadir 100 μL de tampón de citometría de flujo y lavar las células centrifugando a 525 x g durante 7 min a temperatura ambiente.
  5. Aspire el sobrenadante y agite suavemente la célula en ráfagas. Añadir 100 μL de paraformaldehído al 0,4% a cada pocillo e incubar durante la noche a 4 °C.
  6. Lavar las células añadiendo 100 μL de tampón de citometría de flujo y pellet por centrifugación a 525 x g durante 7 min a temperatura ambiente.
  7. Vuelva a suspender las células en 400 μL de tampón de citometría de flujo y analice con un citómetro de flujo.

7. Ensayo in vitro para evaluar la eficacia fagocítica de macrófagos derivados de la médula ósea neonatal

  1. Vuelva a suspender los BMDM en DMEM completo sin rojo de fenol ni antibióticos y siembróguelos a una densidad de 2 × 105/ cuadrante en una placa cuádruple de 35 mm a un volumen de 500 μL.
  2. Para preparar el inóculo bacteriano a una multiplicidad de infección (MOI) de 25 u otro MOI deseado, retire una reserva precalculada de Escherichia coli O1:K1:H7 almacenada a -80 °C.
  3. Alícuota el volumen deseado de bacterias en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Lave las bacterias agregando PBS a un volumen total de 1 mL. Granular las bacterias por centrifugación a 2.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Repita el paso de lavado.
  4. Vuelva a suspender el gránulo bacteriano en 50 μL de PBS y agregue un colorante verde fluorescente sensible al pH hasta una concentración final de 500 μM. Se trata de un colorante sensible al pH sin señal fluorescente a pH neutro y emite fluorescencia brillante en ambientes ácidos, como los fagosomas acidificados, durante el proceso de fagocitosis.
  5. Incubar las células bacterianas durante 20 minutos en la oscuridad para la conjugación del tinte.
  6. Lavar las bacterias cuatro veces con 1 mL de PBS por centrifugación a 1000 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
  7. Resuspender las bacterias en 500 μL de DMEM completo sin rojo de fenol y añadir a los cultivos de BMDM.
  8. Incubar los BMDM a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5% durante 4 h y luego añadir 200 ng de un colorante fluorescente rojo permeable a las células que tiñe los lisosomas.
    NOTA: Las bacterias fagocíticas se pueden visualizar mediante microscopía fluorescente.

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Resultados

Utilizando el método descrito en este estudio, se pueden aislar con éxito de 25 a 37 millones de células de médula ósea de una camada de cinco crías de ratón C57BL/6. Este método ha sido validado con tamaños de camada que oscilan entre 5 y 7 crías. La edad mínima para el aislamiento en nuestros experimentos ha sido de 7 días. Dependiendo del tamaño de la camada y del número de células necesarias para el experimento, que es inferior a un millón, los investigadores podrían intentar este protocolo para ratones menores de 7 ...

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Discusión

La investigación con modelos de ratones neonatos puede presentar una serie de desafíos. Los neonatos tienen un sistema inmunológico en desarrollo que es único en comparación con los adultos8. Como tal, no se debe asumir que los datos generados a partir de modelos animales adultos se aplican a los recién nacidos, y varios trabajos publicados han articulado bien esta idea18,19. Por lo tanto, se necesitan modelos neonatales específicos y fuen...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses relevantes para este artículo.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud [R01 AI163333] para CMR. Reconocemos el apoyo financiero adicional brindado a la Instalación Central de Citometría de Flujo y Célula Única de la Universidad de Virginia Occidental mediante las siguientes subvenciones: WV CTSI grant GM104942, Tumor Microenvironment CoBRE grant GM121322 y NIH grant OD016165.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
40 y micro; colador mGreiner542040Cultivo celular
Placa inferior redonda (U) de 96 pocillosThermo Scientific12-565-65Cultivo celular
Anti-ratón CD11b-BV786BD Biosciences740861Análisis FACS
Anti-ratón CD206-Alexa Fluor488BD Biosciences141709Análisis FACS
Anti-ratón F4/80-PEBD Biosciences565410Análisis FACS
Countess3Thermo ScientificTSI-C3ACCContador celular automatizado
DMEMHycloneSH30022.01Cultivo celular
DMSOVWRWN182Cultivo celular
DPBS, 1xCorning21-031-CVCultivo celular
Escherichia coli O1:K1:H7ATCC11775Infección
EVOS FL Invitrogen12-563-649 Sistema deImágenes Celulares 
FBSAvantor 76419-584Cultivo celular
FluoroBright BMDMThermo fisher ScientificA1896701Medios de cultivo sin colorantes
GlutaminaCytivaSH30034.01Cultivo celular
HEPESCytivaSH30237.01Cultivo celular
L-929ATCCDiferenciación
LSRFortessaBecton DickinsonCitómetro
de flujo Lysotracker rojo DND 99InvitrogenL7528Colorante fluorescente
MEMCorning15-010-CVCultivo celular
Penicilina /estreptomicina HycloneSV30010Cultivo celular
pHrodo verde STP éster InvitrogenP35369Matraz de colorante fluorescente
T75Cell star658170Cultivo celular
Tripsina-EDTAGibco25300120Cultivo celular
Zeiss 710 ZeissP20GM103434Confocal

Referencias

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