Murin Dalak Dokusu Oluşumunu Araştırmak için Bazal Membran Matris Kapsüllü Hücre Agregasyonu
Summary
Bu makale, yarı katı bir bazal membran matrisi içinde dalak hücrelerini toplamak ve kapsüllemek için bir protokolü açıklamaktadır. Bazal membran matris yapıları, organoid gelişimini incelemek için veya in vivo transplantasyon ve doku rejenerasyon çalışmaları için üç boyutlu kültürde kullanılabilir.
Abstract
Dalak, kan yoluyla bulaşan bağışıklık tepkilerinde önemli bir rol oynayan bir bağışıklık organıdır. Bu dokunun anatomik veya fonksiyonel kaybı, ciddi kan enfeksiyonlarına ve sepsise yatkınlığı artırır. Dalak dilimlerinin ototransplantasyonu, kaybedilen dokuyu değiştirmek ve bağışıklık fonksiyonunu eski haline getirmek için klinik olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, sağlam ve immünolojik olarak fonksiyonel dalak dokusu rejenerasyonunu yönlendiren mekanizma tam olarak aydınlatılamamıştır. Burada, dalak dokusu oluşumu için hücresel gereksinimleri araştırmak amacıyla dalak hücrelerini yarı katı bir matriks içinde toplamak ve kapsüllemek için bir yöntem geliştirmeyi amaçlıyoruz. Bazal membran matris kapsüllenmiş hücre yapıları, hem üç boyutlu organoidlerin in vitro doku kültürüne hem de doğrudan in vivo doku oluşumunu değerlendirmek için böbrek kapsülü altına transplantasyona uygundur. Agregasyon ve kapsülleme için giriş hücrelerini manipüle ederek, hayvan nakli modelleri altında dalak dokusu rejenerasyonu için greft kaynaklı PDGFRβ+MAdCAM-1– neonatal stromal hücrelerin gerekli olduğunu gösterdik.
Introduction
Dalağın travmatik rüptürü ve vücutta çok sayıda dalak nodülünün ortaya çıkması, dalak dokusunun rejeneratif kapasite barındırdığının ilk göstergelerinden biriydi 1,2. Dalak ototransplantasyonları daha sonra acil splenektomi gerektiren hastalarda dalak dokusunu korumak için kliniğe tanıtıldı3. Yine de, onlarca yıldır klinik uygulamanın bir parçası olmasına rağmen, dalağın nasıl yenilendiği hakkında çok az şey bilinmektedir. Hayvan nakli modelleri, dalak rejenerasyonu ve bağışıklık fonksiyonunun çoklu parametreleri hakkında fikir vermiştir 4,5. Özellikle, greft hazırlama yönteminde yapılan deneysel modifikasyonlar, doku rejenerasyonunun hücresel ve moleküler düzeyde daha ayrıntılı olarak incelenmesine izin vermiştir.
Tüm dalak dilimlerini içeren transplantasyonlar, yeni bir dalak yapısı yeniden inşa edilmeden önce bir kitle nekrozu evresine girer6. Greft nekrozunun ilk aşaması, nakledilen dokunun büyük kısmının büyük ölçüde kırmızı ve beyaz kan hücrelerinden oluştuğunu ve dalak rejenerasyonu için gereksiz olduğunu düşündürmektedir. Bu, fare böbrek kapsülü altına nakledilmeden önce hematopoietik hücrelerin dalak greftlerinden çıkarılmasıyla deneysel olarak araştırıldı. Burada, stromal ve endotel hücrelerini içeren dalağın lökosit olmayan/eritrosit olmayan fraksiyonunun, de novo doku oluşumunu indüklemek için yeterli olduğu gösterilmiştir7. Dalak stromal dokusu, hücresel greft bileşimini manipüle etmek için hücre sıralama teknolojilerinin kullanılmasını sağlayan tek hücreli bir süspansiyona daha fazla işlenebilir. Aday hücre tiplerini seçici olarak çıkararak, greft gelişimi için vazgeçilmez olan iki CD45-TER-119-stromal hücre popülasyonu tanımlandı: endotel benzeri bir CD31 + CD105 + MAdCAM-1 + hücre popülasyonu ve daha geniş bir şekilde tanımlanmış bir PDGFRβ + mezenkimal hücre popülasyonu8.
Dalak hücrelerinden greft yapımı, destek materyalleri ve hücre yükleme işlemleri açısından farklılık gösterir. Doku mühendisliği ile tasarlanmış dalaklar daha önce bir poliglikolik asit/poli-L laktik asit polimer iskelesi 5,9 üzerine dalak üniteleri yüklenerek hazırlanmıştı. İlginç bir şekilde, bir kollajen süngeri içine emilen dalak stromal hücreleri aşılamayı başaramazken, bir kollajen tabakası üzerine toplanan ve yüklenen stromal hücreler dalak rejenerasyonunu kolaylaştırdı8. Bir Matrigel matrisi içindeki dalak stromal hücrelerinin yeniden süspansiyonunun, üç boyutlu kültür koşulları altında hücre agregasyonunu indüklediğide gösterilmiştir 10. Bununla birlikte, bu yöntem transplantasyon modellerinde kullanım için test edilmemiştir. Mevcut protokolün genel amacı, dalak stromal hücrelerini doğrudan bazal membran matrisi içinde zorla toplamak ve kapsüllemektir, bu daha sonra üç boyutlu bir in vitro doku kültürü sistemine aktarılabilir veya hayvan modeli transplantasyonları için bir araç olarak kullanılabilir (Ek Şekil 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Yenidoğan dalak hücrelerinin yarı katı bir ortam içinde toplanması, dalak yapıları oluşturmak için uygun bir yöntemi temsil eder. Üç boyutlu dalak kültürlerini başlatmak için benzer bazal membran matris tabanlı protokoller kullanılmıştır10. Burada, dalak yapılarının in vitro organoid kültür sistemlerine ve in vivo transplantasyon modellerine eşit derecede uygun olduğunu gösteriyoruz. Dikkat çekici bir şekilde, in vitro kültürlenmiş dala…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (#GNT1078247) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes | Corning | CLS4401 | For placing inside a 14 ml conical tube |
| B-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Stock 55 mM, use at 50 uM |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | From Clostridium histolyticum |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | Sigma-Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | 4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered. |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered |
| Eclipse 200 μl Pipette Tips | Labcon | 1030-260-000 | Bevel Point |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | Lot# 1382243 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Stock 100X, use at 1X |
| Matrigel | Corning | 354263 | Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186 |
| MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140076 | Stock 100X, use at 1X |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin |
| Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27216 | 70 μm |
| Ring Tweezers | NAPOX | A-26 | Ring size: 3 mm |
| Rock Inhibitor (Y-27632) | MedChemExpres | HY-10071 | |
| Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge | Thermofisher | Acceleration and deceleration speeds were set to 8 | |
| Ultra Fine Tweezers | EMS | 78340-51S | Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish. |
| Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel | Ethicon | J283G | |
| Wiretrol II Long Wire Plunger | Drummond | 5-000-2002-L | Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long |
| Wound Clip Applier | MikRon | 427630 | |
| Wound Clips | MikRon | 427631 | 9 mm |
Referencias
- Jarcho, S., Andersen, D. Traumatic autotransplantation of splenic tissue. American Journal of Pathology. 15 (5), 527-546 (1939).
- Storsteen, K. A., ReMine, W. Rupture of the spleen with splenic implants: splenosis. Annals of Surgery. 137 (4), 551-557 (1953).
- Mizrahi, S. Posttraumatic autotransplantation of spleen tissue. Archives of Surgery. 124 (7), 863 (1989).
- Miko, I., et al. Spleen autotransplantation. Morphological and functional follow-up after spleen autotransplantation in mice: A research summary. Microsurgery. 27 (4), 312-316 (2007).
- Grikscheit, T. C., et al. Tissue-engineered spleen protects against overwhelming Pneumococcal sepsis in a rodent model. Journal of Surgical Research. 149 (2), 214-218 (2008).
- Pabst, R., Westermann, J., Rothkotter, H. Immunoarchitecture of regenerated splenic and lymph node transplants. International Review of Cytology. 128, 215-260 (1991).
- Tan, J. K. H., Watanabe, T. Murine spleen tissue regeneration from neonatal spleen capsule requires lymphotoxin priming of stromal cells. The Journal of Immunology. 193 (3), 1194-1203 (2014).
- Tan, J. K. H., Watanabe, T. Stromal cell subsets directing neonatal spleen regeneration. Scientific Reports. 7 (1), 40401 (2017).
- Gee, K., et al. Spleen organoid units generate functional human and mouse tissue-engineered spleen in a murine model. Tissue Engineering Part A. 26 (7-8), 411-418 (2020).
- Ueno, Y., et al. Transcription factor Tlx1 marks a subset of lymphoid tissue organizer-like mesenchymal progenitor cells in the neonatal spleen. Scientific Reports. 9 (1), 20408 (2019).
- . Online data repository: Matrigel encapsulated cell aggregation for investigating murine spleen tissue formation Available from: https://osf.io/ehrbw/?view_only=7d6a8e05c84144d3a12d36ffe7f94f01 (2023)
