Este protocolo describe un método eficiente para detectar cuantitativamente el daño oxidativo del ADN en células MCF-7 mediante la tecnología ELISA.
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Artículo de método
Cuantificación del nivel de 8-oxo-dG mediante el ensayo ELISA para evaluar el daño oxidativo del ADN en células MCF-7
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Resumen
Resumen
La base 8-Oxo-7,8-dihidro-2'-desoxiguanosina (8-oxo-dG) es la forma predominante de daño oxidativo del ADN comúnmente observado. El deterioro del ADN afecta profundamente la expresión génica y sirve como un factor fundamental en la estimulación de los trastornos neurodegenerativos, el cáncer y el envejecimiento. Por lo tanto, la cuantificación precisa de 8-oxoG tiene importancia clínica en la investigación de las metodologías de detección de daños en el ADN. Sin embargo, en la actualidad, los enfoques existentes para la detección de 8-oxoG plantean desafíos en términos de conveniencia, conveniencia, asequibilidad y mayor sensibilidad. Empleamos la técnica de ensayo de inmunoadsorción enzimática tipo sándwich (ELISA), un método colorimétrico altamente eficiente y rápido, para detectar variaciones en el contenido de 8-oxo-dG en muestras de células MCF-7 estimuladas con diferentes concentraciones de peróxido de hidrógeno (H2O2). Determinamos la concentración deH2O2que induce daño oxidativo en las células MCF-7 mediante la detección de su valor de IC50 en las células MCF-7. Posteriormente, tratamos las células MCF-7 con 0, 0,25 y 0,75 mM H2O2 durante 12 h y extrajimos 8-oxo-dG de las células. Finalmente, las muestras fueron sometidas a ELISA. Después de una serie de pasos, que incluyen la distribución de la placa, el lavado, la incubación, el desarrollo del color, la terminación de la reacción y la recopilación de datos, detectamos con éxito cambios en el contenido de 8-oxo-dG en las células MCF-7 inducidos porH2O2. A través de estos esfuerzos, nuestro objetivo es establecer un método para evaluar el grado de daño oxidativo del ADN dentro de las muestras celulares y, al hacerlo, avanzar en el desarrollo de enfoques más convenientes y convenientes para la detección de daños en el ADN. Este esfuerzo está preparado para hacer una contribución significativa a la exploración de análisis asociativos entre el daño oxidativo del ADN y varios dominios, incluida la investigación clínica sobre enfermedades y la detección de sustancias tóxicas.
Introducción
El daño oxidativo del ADN es consecuencia de un desequilibrio entre la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el sistema de defensa antioxidante celular1. Implica principalmente la oxidación de las bases de ADN, purina y pirimidina 2,3. Esta modificación oxidativa de las bases del ADN no solo compromete la integridad del genoma, sino que también abarca una amplia gama de problemas patológicos, como el cáncer, las enfermedades neurodegenerativas y las enfermedades cardiovasculares 4,5. La base de guanina en el ADN ti....
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Protocolo
1. Construcción de un modelo dedaño oxidativo del ADN inducido porH2O2en células MCF-7
- Recuperación de células MCF-7
- Transfiera rápidamente el tubo criogénico de cultivo celular, que contiene 3,5 x 106 células MCF-7 y se almacena en un refrigerador a -80 °C, a una caja de espuma que contiene nitrógeno líquido. Recupere el tubo con pinzas y colóquelo en un baño de agua a temperatura constante a 37 °C durante aproximadamente 1 minuto para descongelar las células conservadas.
NOTA: Durante el proceso de descongelación en un baño de agua, agite las células de forma intermitente para ase....
- Transfiera rápidamente el tubo criogénico de cultivo celular, que contiene 3,5 x 106 células MCF-7 y se almacena en un refrigerador a -80 °C, a una caja de espuma que contiene nitrógeno líquido. Recupere el tubo con pinzas y colóquelo en un baño de agua a temperatura constante a 37 °C durante aproximadamente 1 minuto para descongelar las células conservadas.
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Resultados
Como se ilustra en la Figura 3, el eje X denota la concentración de H2O2 aplicada a las células MCF-7, mientras que el eje Y indica la viabilidad de la célula. El tratamiento con 0,75 mM durante 12 h redujo la viabilidad de las células MCF-7 al 67%. Concomitantemente con el aumento de la concentración, hubo una disminución significativa en la viabilidad de las células MCF-7, particularmente a una concentración de 1,5 mM, donde la viabilidad disminuyó por debajo del 3% (.......
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Discusión
El desarrollo de métodos ELISA es de gran importancia tanto para las metodologías de detección de daños en el ADN existentes como para las nuevas. En comparación con las técnicas tradicionales de HPLC y espectrometría de masas, este enfoque no solo es fácil de usar, sino que también exhibe una alta sensibilidad y cumple con las demandas de detección de alto rendimiento30. Esto permite la monitorización de 8-oxo-dG en estudios de cribado de enfermedades a gran escala, lo que facilita una comprensió.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo contó con el apoyo del Equipo de Investigación Innovadora de Ciencia y Tecnología de la Institución de Educación Superior de Jiangsu (2021), el Programa del Centro de Investigación de Tecnología de Ingeniería del Colegio Vocacional de Jiangsu (2023), el Programa de Tecnología Clave de los Proyectos Tecnológicos de Sustento del Pueblo de Suzhou (SKY2021029), el Proyecto Abierto del Biobanco de Recursos Clínicos de Jiangsu (TC2021B009), el Proyecto del Laboratorio Estatal Clave de Medicina Radiológica y Protección, Universidad de Soochow (GZK12023013), programas del Colegio de Salud Vocacional de Suzhou (SZWZYTD202201) y Proyecto Qing....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0.25% Trypsin-EDTA(1x) | Gibco | 25200-072 | |
| Kit de conteo de células-8 | Dojindo | CK04 | |
| Placa de recuento de células | QiuJing | XB-K-25 | |
| CO2 incubadora | Thermo | 51032872 | |
| DMEM basic(1X) | Gibco | C11995500BT | |
| FBS | PAN | ST30-3302 | |
| GraphPad Prisma X9 | GraphPad Software | de análisis estadístico | |
| centrífuga de alta velocidad | Thermo | 9AQ2861 | |
| Kit ELISA 8-oxo-dG humano | Zcibio | ZC-55410 | |
| L-1000XLS+ Pipetas | Rainin | 17014382 | |
| L-20XLS+ Pipetas | Rainin | 17014392 | |
| tanque de nitrógeno líquido | Mvecryoge | YDS-175-216 | |
| MCF-7 CELL | BNCC | BNCC100137 | |
| Multiskan FC Fotómetro de microplaca | Thermo | 1410101 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Solución de penicilina-estreptomicina, 100X | Beyotime | C0222 | |
| Microscopio trinocular de células vivas | Motic | 1.1001E+12 | |
| Congelador de ultra baja temperatura | Haire V118574 |
Referencias
- Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: Mechanisms, mutation, and disease. Faseb J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
- Dizdaroglu, M., Jaruga, P. Mechanisms of free radical-induced damage to DNA. Free Radic Res. 46 (4), 382-419 (2012).
- Cadet, J....
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Reimpresiones y permisos
