El presente protocolo describe las mediciones de pH en organoides gástricos derivados de tejidos humanos utilizando microelectrodos para la caracterización espacio-temporal de la fisiología intraluminal.
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Artículo de método
Perfilado del pH luminal en organoides gastrointestinales tridimensionales mediante microelectrodos
En este artículo
Resumen
Resumen
La optimización y caracterización detallada de modelos de organoides gastrointestinales requiere métodos avanzados para analizar sus entornos luminales. Este artículo presenta un método altamente reproducible para la medición precisa del pH dentro de la lumina de organoides gástricos humanos en 3D a través de microelectrodos controlados por micromanipuladores. Los microelectrodos de pH están disponibles en el mercado y consisten en puntas de vidrio biseladas de 25 μm de diámetro. Para las mediciones, el microelectrodo de pH se introduce en el lumen de un organoide (>200 μm) que está suspendido en Matrigel, mientras que un electrodo de referencia descansa sumergido en el medio circundante en la placa de cultivo.
Utilizando estos microelectrodos para perfilar organoides derivados del cuerpo gástrico humano, demostramos que el pH luminal es relativamente consistente dentro de cada cultivo bien a ~7,7 ± 0,037 y que se pueden obtener mediciones continuas durante un mínimo de 15 min. En algunos organoides más grandes, las mediciones revelaron un gradiente de pH entre la superficie epitelial y el lumen, lo que sugiere que las mediciones de pH en organoides se pueden lograr con alta resolución espacial. En un estudio anterior, los microelectrodos se utilizaron con éxito para medir las concentraciones de oxígeno luminal en organoides, lo que demuestra la versatilidad de este método para el análisis de organoides. En resumen, este protocolo describe una herramienta importante para la caracterización funcional del espacio luminal complejo dentro de organoides 3D.
Introducción
Los organoides, estructuras multicelulares en miniatura derivadas de células madre, han revolucionado nuestra capacidad para estudiar la fisiología humana y están comenzando a reemplazar a los modelos animales, inclusoen entornos regulatorios. Desde la descripción inicial de los organoides intestinales por Sato et al. en 2009, la tecnología de organoides se ha vuelto inmensamente popular2. Un gran número de estudios han caracterizado con gran detalle la composición celular y la función de los modelos de organoides 3,4,5,6.<....
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Protocolo
Este protocolo requiere organoides 3D de al menos 200 μm de diámetro que tengan un lumen distinto y que estén incrustados en una matriz extracelular artificial (ECM, por ejemplo, Matrigel). Los tejidos gástricos humanos para la derivación de organoides se obtuvieron con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Estatal de Montana y el consentimiento informado de los pacientes que se sometieron a una endoscopia superior en Bozeman Health (protocolo # 2023-48-FCR, a D.B.) o como muestras exentas de gastrectomía de estómago entero o manga del Intercambio Nacional de Investigación de Enfermedades (protocolo #DB062615-EX). La información sobre l....
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Resultados
La secreción de ácido es una función crucial del estómago humano. Sin embargo, hasta qué punto la secreción ácida puede modelarse en organoides sigue siendo un tema de debate 6,32,33,34. Por lo tanto, desarrollamos el protocolo detallado anteriormente para medir con precisión la producción de ácido en organoides gástricos. En particular, utilizamos organoides derivados de células madre adultas .......
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Discusión
El acceso limitado al espacio luminal de los organoides ha restringido severamente nuestra comprensión de la dinámica fisiológica de este microambiente. Una herramienta fiable para los análisis funcionales de la fisiología luminal ampliará nuestra capacidad de aprovechar los organoides como modelos in vitro para la fisiología, la farmacología y la investigación de enfermedades. Los organoides son modelos altamente ajustables, fisiológicamente relevantes, con el potencial añadido de replicar la variabilidad genét.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a la Dra. Ellen Lauchnor, al Dr. Phil Stewart y a Bengisu Kilic por su trabajo previo y su asistencia con los microsensores deO2 ; Andy Sebrell por su formación en cultivo de organoides y micromanipulación; Lexi Burcham por su asistencia en el cultivo de organoides, la preparación de los medios, el registro de datos y la organización; y la Dra. Susy Kohout para consejos generales en electrofisiología. Nos gustaría agradecer a la Dra. Heidi Smith por su ayuda con las imágenes y reconocer a la Instalación de Bioimágenes del Centro de Ingeniería de Biopelículas de la Universidad Estatal de Montana, que cuenta con el apoyo financier....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 3 M KCl | Unisense | ||
| 5 mL Pipeta Serológica sin Bamboleo, Envuelta Individualmente, Papel/Plástico, Bolsa, Estéril | CellTreat | 229091B | |
| 10 mL Pipeta Serológica sin Bamboleo, Envuelta Individualmente, Papel/Plástico, Bolsa, Estéril | CellTreat | 229092B | |
| 15 mL Tubo de Centrífuga - Estante de Espuma, | Estéril CellTreat | 229412 | |
| Placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos, | CellTreat | 229124 | |
| 25 mL Pipeta serológica sin bamboleo, envuelta individualmente, papel/plástico, bolsa, | CellTreat | estéril 229093B | |
| Plato de 35 mm | Nº 1.5 Cubreobjetos | Diámetro de vidrio de 20 mm | Tubo | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| 50 mL sin recubrimiento - Estante de espuma, | CellTreat | 229422 | |
| etanol al 70% | BP82031GAL BP82031GAL | ||
| 70 μ m Filtro de células, envuelto individualmente, estéril | CellTreat | 229483 | |
| 1.000 y micro; l Puntas de pipeta de baja retención de longitud extendida, en estanterías, estériles | CellTreat | 229037 | |
| solución de anfotericina B (Fungizone) | HyClone Laboratories, Inc | SV30078.01 | |
| Gabinete de bioseguridad | Nuaire | NU-425-600 | Clase II Tipo A/B3 |
| Albúmina sérica bovina | Biorreactivos Fisher | BP1605-100 | |
| Solución de recuperación | Corning | 354253 | Solución de disociación celular |
| DMEM/F-12 (DMEM avanzado) | Gibco | 12-491-015 | |
| Modificación de Dulbecco del medio Eagles (DMEM) | Fisher Scientific | 15017CV | |
| Suero fetal bovino | HyClone Laboratories, Inc | SH30088 | |
| G418 Sulfato | Corning | 30-234-CR | |
| Sulfato de gentamicina | IBI Scientific | IB02030 | |
| HEPES, Ácido Libre | Cytiva | SH30237.01 | |
| HP Pavillion 2 en 1 14" Portátil Intel Core i3 | HP | M03840-001 | |
| Ácido clorhídrico | Fisher Incubadora Scientific | A144C-212 | |
| Fisher Scientific | 11676604 | ||
| cámara iPhone 12 | Apple | ||
| L-glutamina | Cytiva | SH3003401 | |
| grande Kimberly-Clark Profesional Kimtech Science Kimwipes Limpiaparabrisas para tareas delicadas, 1 capa | Fisher Scientific | 34133 | |
| M 205 FA Microscopio estereoscópico | Leica | ||
| Matrigel Matriz de Membrana 354234 | Corning | CB-40234 | |
| MC-1 Controlador UniMotor | Unisense | ||
| Rojo | |||
| MM33 Micromanipulador | Marzhauser Wetzlar | 61-42-113-0000 | |
| Diestro MS-15 Escenario Motorizado Unisense | |||
| Nanoject-II | Autoinyector de nanolitros | Drummond | 3-000-204 |
| Penicilina/Estreptomicina (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-148 | |
| Microelectrodos de pH | Unisense | 50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160 | El software SensorTrace no es compatible con las computadoras Apple |
| Electrodo de referencia | Unisense | REF-RM-001652 | El software SensorTrace no es compatible con Ordenadores Apple |
| SB 431542 | Tocris Bioscience | 16-141-0 | |
| Adaptador de cámara para smartphone | Gosky | ||
| Especificaciones Soporte de laboratorio LS | Unisense | LS-009238 | |
| Tripsina-EDTA 0,025%, rojo fenol | Gibco | 25-200-056 | |
| UniAmp | Unisense | 11632 | |
| United Biosystems Inc MINI RASCADORES DE CÉLULAS 200/PK | Fisher | MCS-200 | |
| Y-27632 diclorhidrato | Tocris Bioscience | 12-541-0 | |
| µ Kit de calibración de sensor | Unisense/ Mettler Toledo | 51-305-070, 51-302-069 | pH 4.01 y 9.21, paquetes de 20 mL |
Referencias
- Zhang, N., et al. Tissue spatial omics dissects organoid biomimicry. GEN Biotechnology. 2 (5), 372-383 (2023).
- Sato, T., et al. Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (....
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Reimpresiones y permisos
