Inyección de perivitelina basada en vectores lentivirales: un método para transducir el gen de interés en ovocitos de ratón unicelulares fertilizados

Para realizar la transfección, tome una cámara especializada que contenga huevos de ratón recién fertilizados suspendidos en una gota de medios apropiados. En esta etapa, el óvulo contiene un gran ovocito central que contiene los pronúcleos paterno y materno.

El ovocito está cubierto por una zona pelúcida rica en glicoproteínas, rodeada de grupos de células cúmulos estrechamente dispuestas incrustadas dentro de la matriz extracelular rica en ácido hialurónico. Ahora, trata los huevos con la enzima hialuronidasa, que digiere el ácido hialurónico. Esto disocia las células del cúmulo, eventualmente exponiendo la zona pelúcida que rodea al ovocito.

Coloque un solo ovocito tratado cerca de la punta de una pipeta de retención y aplique presión de succión para restringir su posición. Tome una aguja de microinyección de calibre estrecho que contiene una suspensión de vector lentiviral diseñada que lleva un transgén encapsulado dentro de la envoltura viral. Estos retrovirus tienen la capacidad inherente de integrarse en el genoma del huésped.

A continuación, perfore la aguja a través de la zona pelúcida para llegar al espacio perivitelino, un espacio entre la zona pelúcida más externa y la membrana plasmática más interna. Introducir la suspensión del vector lentiviral en el espacio perivitelino e incubar para facilitar la transducción, un proceso de transferencia genética mediada por virus.

El vector viral se fusiona con la membrana del ovocito, permitiendo la liberación del ARN transgénico en el citoplasma de los ovocitos, que se transcribe a la inversa en ADN bicatenario. Eventualmente, el ADN se integra en loci específicos en el genoma del huésped, lo que da como resultado la expresión transgénica.

En preparación, centrifugar la suspensión del vector lentiviral preparada a 160 g durante 2 minutos para granular los restos que a menudo están presentes en el stock lentiviral congelado. En un gabinete de seguridad de Clase II, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 0.5 mililitros. A continuación, cargue 1 microlitro de sobrenadante en una pipeta de inyección, luego, conecte la pipeta de inyección al micromanipulador del lado derecho y conecte la pipeta de retención al micromanipulador del lado izquierdo.

Ahora, dispense 8 microlitros de medio M2 en el centro del portaobjetos de depresión y cúbralo con aceite de parafina ligero para evitar la evaporación. Luego, coloque 20 huevos en los lugares poco profundos de la gota sin crear burbujas. A continuación, asegúrese de que la punta de la pipeta de inyección esté abierta. Si no es así, golpee la pipeta de inyección con la pipeta de retención para abrirla, luego configure el inyector para inyecciones de 20 segundos.

Ahora, usando la pipeta de retención y la presión manual, aspire un óvulo fertilizado que contiene dos pronúcleos y dos cuerpos polares. Luego, usando la pipeta de inyección, inyecte el espacio perivitelino del huevo.

No toque la membrana plasmática. Ajuste la presión para que el espacio perivitelino se llene de solución. La presión no debe exceder los 600 hectopascales. Inmediatamente después de inyectar los 20 huevos, transfiera el lote a un baño de medio M16 precalentado e incube durante al menos 30 minutos antes de implantarlos.