Un ensayo para estudiar el impacto de la rigidez de la matriz extracelular en la infección bacteriana

Tome pocillos que contienen hidrogeles de poliacrilamida de rigidez variable recubiertos con colágeno, imitando una matriz extracelular fisiológica o ECM.

Agregue células endoteliales microvasculares que forman adherencias focales, o FA, complejos que median la unión de la ECM celular, para detectar la rigidez del hidrogel.

Los hidrogeles más rígidos elevan la expresión de vimentina en la superficie celular, un componente citoesquelético, en comparación con los hidrogeles más blandos.

Agregue la bacteria Listeria monocytogenes, diseñada para expresar una proteína fluorescente bajo el promotor de la proteína inductora del ensamblaje de actina, o ActA.

Centrifugar para sincronizar el contacto bacteriano con las células huésped e incubar.

Las bacterias se unen a la vimentina. Más vimentina en las células huésped más rígidas unidas a hidrogel conduce a una mayor adherencia bacteriana y endocitosis.

Agregue un antibiótico, eliminando las bacterias no internalizadas.

Las bacterias internalizadas secretan toxinas, rompiendo la membrana del endosoma. El escape citoplasmático activa el promotor ActA para expresar la proteína fluorescente, marcando bacterias intracelulares.

Desprender enzimáticamente las células. Mediante citometría de flujo, detecta una mayor fluorescencia en las células huésped que residen en hidrogeles más rígidos, lo que indica una mayor internalización bacteriana.

Después de preparar un cultivo nocturno de L. monocytogenes de acuerdo con el protocolo de texto, transfiera 1 mililitro del cultivo a un tubo de microcentrífuga y gírelo a 2,000 veces g y temperatura ambiente durante 4 minutos. Después de usar PBS de grado de cultivo de tejidos para lavar el gránulo dos veces, use 1 mililitro de PBS para volver a suspender el gránulo.

Prepare la mezcla de infección combinando 10 o 50 microlitros de la suspensión bacteriana con 1 mililitro de medio completo MCDB-131 para una multiplicidad de infección, o MOI, de aproximadamente 50 bacterias por célula huésped o 10 bacterias por célula huésped. Retire el medio de los pocillos de las placas de 24 pocillos, teniendo cuidado de no alterar los hidrogeles ni las células. Use 1 mililitro de MCDB-131 medio completo para lavar las células una vez, luego, agregue 1 mililitro de bacterias a cada pocillo.

Coloque la tapa en los platos y envuélvalos con papel film de polietileno para evitar fugas. Centrifugar las placas a 2,000 veces g durante 10 minutos para sincronizar la invasión. Luego, incube los cultivos a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Con MCDB-131 medio completo, lave las muestras 4 veces y devuélvalas a la incubadora de cultivo de tejidos. Después de 30 minutos adicionales, reemplace el medio con MCDB-131 medio completo complementado con 20 microgramos por mililitro de gentamicina.

Para llevar a cabo la citometría de flujo ocho horas después de la infección, retire el medio de los pocillos de la placa de 24 pocillos y use PBS de cultivo de tejidos para lavar los pocillos una vez. Después de la eliminación del PBS, agregue 200 microlitros de mezcla de tripsina-EDTA-colagenasa a cada pocillo. Coloque la placa en la incubadora de cultivo de tejidos durante 10 minutos para permitir el desprendimiento completo de las células.

Después de pipetear suavemente cada pocillo ocho veces, agregue 200 microlitros de medio completo para neutralizar la tripsina. Transfiera los 400 microlitros de solución celular de cada pocillo a un tubo de poliestireno de 5 mililitros con una tapa de filtro celular de 35 micrómetros. Analizar las muestras mediante citometría de flujo.