Experimentele Generatie van Carcinoom-geassocieerde fibroblasten (cafe's) van Human Borst fibroblasten

Deze video beschrijft een procedure om carcinoom-geassocieerde fibroblasten of CAF's te genereren uit primair gecultiveerde menselijke fibroblasten. Carcinomen zijn complexe weefsels bestaande uit neoplastische cellen en een niet-kankerous compartiment dat het stroma wordt genoemd. Het tumor-geassocieerde stroma bestaat uit extracellulaire matrix en een verscheidenheid aan stromale cellen, waaronder fibroblasten, myofibroblasten, endotheelcellen, pericyten en leukocyten; carcinoom-geassocieerde fibroblasten zijn rijk aan myofibroblasten, een kenmerk van geactiveerde fibroblasten die binnen de tumor aanwezig zijn.

Stromale cellen spelen een belangrijke rol bij het stimuleren van tumorprogressie. Deze kunnen in vitro worden gegenereerd door eerst primaire humane mammaire fibroblasten te isoleren uit gezond borstweefsel verkregen via een reductiemammoplastiek. Het verkregen weefsel wordt gedissocieerd tot een enkelcellige suspensie, waarna het wordt geïmmortaliseerd door virale transductie en genetisch wordt gemodificeerd om GFP en een puramycine-resistentiegen tot expressie te brengen.

De cellen worden vervolgens samen met menselijke borstcarcinoom MCF7-cellen subcutaan in een immuundeficiënte muis geïnjecteerd. De geïnjecteerde menselijke dermale fibroblasten zullen evolueren tot tumorbevorderende kanker-myofibroblasten.

Vervolgens worden de ouderlijke humane mammafibroblasten uit tumorxenografts geëxtraheerd en gekweekt in aanwezigheid van purmycine. De resulterende purmycine-resistente cellen, genaamd experimenteel gegenereerde CAF's of exp-CAF's, worden geanalyseerd. Immunohistochemische analyse onthult dat de aanvankelijk aanwezige normale humane mammafibroblasten binnen de tumorxenograft evolueren naar CAF-myofibroblasten die het vermogen hebben verworven om tumorgenese te bevorderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals extractie van primaire CAF's van borstkankerpatiënten, is dat we in staat zijn om experimenteel CAF's te genereren uit humane borstfibroblasten door middel van co-implantatie van de tumor.

De algemene modeldemonstratie van de procedure zal worden uitgevoerd door Kar, een postdoctoraal onderzoeker in mijn laboratorium, en Ahmed Kar, een PhD-student in het lab. Begin met één gram gezond menselijk borstweefsel, weggenomen tijdens een reductiemammoplastiek. Was het weefsel meerdere keren in PBS, plaats het weefsel vervolgens in een petrischaal van 15 centimeter en gebruik een steriel scheermesje om het fijn te snijden in kleine fragmenten kleiner dan 1,5 millimeter kubiek.

Gebruik vervolgens het scheermesje om de weefselfragmenten over te brengen naar een conische buis van 15 milliliter die 10 milliliter cel-dissociatiebuffer bevat per halve gram weefsel. Vortex daarna gedurende één minuut op maximale snelheid. Plaats de buis op een rocker in een incubator van 37 °C en laat de weefselfragmenten 12 tot 18 uur verteren.

De volgende dag zullen er nog steeds veel stukjes onverteerde weefselfragmenten in de vortexbuis aanwezig zijn. Plaats de buis eerst op maximale snelheid op het aanrecht en incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur zonder agitatie. Gebruik na de incubatie een fysiologische pipette van vijf milliliter om het resulterende, met stromale cellen verrijkte SUP-supernatant over te brengen naar een nieuwe conische buis.

Centrifuge vervolgens de stromale fractie gedurende vijf minuten bij 250 ×g. Resuspendeer na het centrifugeren de celpellet in PBS en centrifugeer deze opnieuw gedurende vijf minuten bij 250 ×g. Resuspendeer de pellet vervolgens in DMEM aangevuld met 10% FCS en breng deze over naar een petrischaal van 15 centimeter.

Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2. Na acht tot 10 dagen moeten de cellen confluent zijn. Op dit punt worden de cellen geoogst en kunnen ze worden ingevroren voor langdurige bewaring.

Om de geïsoleerde primaire normale menselijke geheugenfibroblasten te immortaliseren, wordt een retrovirale P MIG-vector geïntroduceerd die zowel H turt als GFP tot expressie brengt. Kweek de cellen gedurende vier tot vijf dagen en sorteer vervolgens de GFP-positieve cellen met behulp van flowcytometrie. Introduceer een retroviraal P babe puro-construct dat een puromycine-resistentiegen codeert in de GFP-gelabelde immortaliseerde fibroblastencultuur. Kweek de cellen gedurende vijf tot zeven dagen in aanwezigheid van puromycine bij een uiteindelijke concentratie van 1 µg/mL.

Om de GFP-gelabelde purmycine-resistente geïmmortaliseerde menselijke geheugenfibroblasten te isoleren. Vervolgens wordt onderzocht of de fibroblasten actieve virussen produceren, wat kan leiden tot de horizontale overdracht van genen die coderen voor GFP en purmycine-resistentie. Kweek 2,5 × 10⁵ purmycine-resistente geïmmortaliseerde menselijke geheugenfibroblasten gedurende twee dagen in een Petri-schaal van 6 cm.

Verzamel het geconditioneerde medium van de fibroblasten en filtreer dit met een spuitfilter met een poriegrootte van 0,45 micron. Voeg dit vervolgens toe aan 10,5 muizenfibroblastcellen en kweek deze gedurende 12 uur in aanwezigheid van 5 µg/mL proteïnesulfaat, wat de efficiëntie van de virusinfectie verhoogt. Na 12 uur wordt het medium vervangen door DMEM aangevuld met 10% FCS en worden de cellen nog twee dagen verder gekweekt.

Onderzoek de cellen met fluorescentiemicroscopie. 10 T en een halve cellen geïnfecteerd door GFP-virus zullen GFP-positief zijn. Vervang nu het medium om de cellen te behandelen met 1 µg/mL.

Behandel gedurende vijf tot zeven dagen met purmycine. Observeer de cellen opnieuw via fluorescentiemicroscopie om vast te stellen of er kolonies zijn gevormd van purmycine-resistente cellen. Houd er rekening mee dat horizontale genoverdracht door actieve virussen, geproduceerd door de ouderlijke purmycine-resistente GFP-gelabelde menselijke mammaire fibroblasten, de omringende purmycine-gevoelige muizen- en carcinoomcellen resistent kan maken.

Puramycine-resistent en GFP-positief binnen de tumorxenograft. Dit kan het proces belemmeren waarbij de geïnjecteerde GFP-gelabelde puramycine-resistente menselijke mammafibroblasten uit de tumorxenograft worden geïsoleerd om experimenteel carcinoom-geassocieerde fibroblasten te genereren voor injectie in een immuundeficiënte muis. Begin met het trypsiniseren en tellen van de zojuist voorbereide menselijke mammalijn samen met de menselijke borstcarcinoomcellijn MCF7 RAs in nieuwe microcentrifugebuisjes.

Suspendeer 1 × 10⁶ MCF7 RA-menselijke borstcarcinoomcellen en 3 × 10⁶ GFP-gelabelde puromycine-resistente geïmmortaliseerde menselijke mammaire fibroblasten in 400 µL kweekmedium met 50% Matrigel per injectie. Plaats de buizen op ijs als controle.

Bereid daarnaast dezelfde humane mammaire fibroblasten voor zonder de MCF seven RA-cellen. Injecteer vervolgens, met behulp van een naald van 27 gauge, het cellengemengsel in een subcutane locatie van een immuundeficiënte naakte muis om de intratumorale variatie van calfs-fenotypen te onderzoeken. Isoleer calfs en controlefibroblasten uit enkele verschillende tumorxenografts.

Implanteer vervolgens elk mengsel in de rechter- en linkerflanken van elke muis. Laat de tumor- of fibroblastxenografts 42 dagen na injectie groeien. De incubatieperiode van de fibroblasten binnen de tumorxenograft moet worden geoptimaliseerd op basis van het myofibroblastfenotype dat is verworven door de ouderlijke fibroblasten in de tumor.

Om de kalf- of controlefibroblasten uit de geëuthanaseerde muis te extraheren, plaatst u ten minste 0,5 gram van het xenograftweefsel en ten minste 0,1 gram van het fibroblasten-xenograftweefsel in aparte schaaltjes. Gebruik vervolgens een steriel scheermesje om het weefsel fijn te snijden in kleine weefselfragmenten van minder dan 1,5 millimeter kubiek. Gebruik vervolgens het scheermesje om de weefselfragmenten over te brengen naar een conische buis van 15 milliliter met cel-dissociatiebuffer en vortex één minuut op maximale snelheid. Incubeer de celsuspensie gedurende drie uur bij 37 °C onder voortdurende langzame agitatie en centrifugeer vervolgens de celsuspensie.

Houd de cellen gedurende vijf minuten bij 250 ×g gecentrifugeerd, gedissocieerd van ofwel de tumor of het fiberglass sano graft. Resuspendeer de celpellet in PBS en herhaal de centrifugatie. Resuspendeer vervolgens de resulterende celpellet in DMEM aangevuld met 10% FCS om een zuivere kweek van puromycine-resistente ouderlijke humane mammaire fibroblasten te isoleren.

De cellen afgeleid van de tumor of fibroblasten worden gekweekt in een Petri schaal van 15 centimeter in aanwezigheid van één µg/mL puromycine bij 37 °C en 5% CO2. Dit zal alle contaminerende carcinoomcellen en/of muizencellen elimineren.

Stroomcellen worden gekweekt tot confluentie, waarna de cellen worden bewaard bij -80 °C met behulp van een vriesmedium. Let op dat de resulterende purmycine-resistente cellen, aangeduid als 42-daagse XP calf one of control fibroblast one cellen, immetaleel zijn en positief voor GFP. Menselijke geheugenfibroblasten versterken hun tumorbevorderende myofibroblastische fenotype binnen het tumorxenograft door interactie met carcinoomcellen tijdens de tumorprogressie. Meng 1 × 10⁶ MCF7 RAs-cellen met 3 × 10⁶ 42-daagse P calf-cellen.

Resuspendeer de cellen in 400 µL cultuurmedium met 50% matrigel voor injectie in een 1,5 mL Eppendorf-buisje. Bereid daarnaast drie keer 10⁶ 42 dagen oude controle-fibroblasten voor (cellen zonder carcinoomcellen) in een Eppendorf-buisje om de tumorbevorderende myofibroblastische fenotypes van de experimentele cellen verder te stimuleren. Injecteer een mengsel van deze cellen met CF7 RA-cellen subcutaan in een naakte muis. Injecteer indien nodig alleen controle-fibroblasten zonder kankercellen om de controlecellen voor te bereiden.

Incubeer exp calf one-cellen gedurende extra perioden van 200 dagen binnen het tumorxenograft om exp C two-cellen te genereren ter versterking van het tumorbevorderende myofibroblastische fenotype. Genereer daarnaast controlefibroblasten two-cellen als controle voor de exp calf two-cellen door controlefibroblasten one-cellen zonder carcinomacellen in een muis te injecteren, verwijder de tumoren en plaats deze in weefkweekschalen.

Dissekeer en dissocieer de tumor of de fibroblast-senografts tot een enkelcel-suspensie en kweek deze. De cellen in een petrischaal van 15 centimeter met 10% F-C-S-D-M-E-M in aanwezigheid van puromycine worden gepropageerd totdat ze confluent zijn; trypsiniseer vervolgens en bewaar de cellen bij -80 °C met behulp van vriesmedium. De resulterende puromycine-resistente cellen worden aangeduid als 242-dagen-oude exp-kalf 2-cellen of controle-fibroblast 2-cellen. GFP-gelabelde exp-kalf 2- en controle-fibroblast 2-cellen geëxtraheerd uit borsttumorksenografts werden immunohistochemisch geanalyseerd; zoals in deze afbeelding te zien is, kleuren de cellen sterk positief voor mesenchymale markers, waaronder mensspecifiek prolyl-4-hydroxylase, collageen 1A, fibronectine, S 100, A4 en fibroblast-oppervlakte-eiwit.

Deze resultaten wijzen op een menselijke oorsprong en een mesenchymale aard van deze cellen. In tegenstelling hiermee kleurde cytokeratine, een marker voor epitheelcellen, niet in deze GFP-positieve fibroblasten. Samen suggereren deze bevindingen dat de EXP C twee- en controle fibroblasten twee-cellen zijn afgeleid van de ouderlijke menselijke mammaire fibroblasten die aanvankelijk in muis-xenografts werden geïntroduceerd.

Kruciaal is dat een veel groter aantal XP calf two-cellen positief kleurde voor alfa SMA en extracellulaire matrix glycoprotein to nasin C, welke beide markers zijn voor myofibroblasten in vergelijking met controle fibroblasten two-cellen. Merk op dat een hoger aandeel alfa smma-positieve myofibroblasten aanwezig is in exp calf two-cellen vergeleken met wat waargenomen werd in 42 dagen oude exp calf one-cellen. Deze gegevens tonen aan dat residente menselijke geheugenfibroblasten tijdens de tumorprogressie na diens ontwikkeling geleidelijk evolueren tot calf-myofibroblasten binnen tumorxenografts.

Het complementatie tumorxenograftmodel maakte de weg vrij voor onderzoekers die werken aan de tumormicro-omgeving om de processen van de evolutie van normale fibroblasten naar kanker te bestuderen. Zoals fibroblasten.