Bir Multititre Plaka Biçimi İnsan Pluripotent Kök Hücreler Nöron Hızlı ve Verimli Üretim

Aşağıdaki deneyin genel amacı, çoklu titrasyon plak formatı kullanarak insan pluripotent kök hücrelerini veya H PSC'leri nöronlara farklılaştırmaktır. Bu işlem, H PSC'lerden oluşan tek hücre süspansiyonunun hasat edilip V tabanlı 96 kuyucuklu plakalara ekilerek gece boyunca embriyo cisimlerinin veya EB'lerin oluşturulmasıyla gerçekleştirilir.

Ardından, nöroektoderm oluşumunu başlatmak için EBS'ler, farklılaşma medyumu içeren U şeklinde ultra düşük yapışma plakalarına aktarılır. Sonrasında, nöronların dışa doğru büyümesini teşvik etmek için EBS'ler matrigel kaplı kaplara ekilir. İmmünofloresan yöntemiyle, sekizinci gün civarında tipik nöronal belirteçlerin varlığını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

İnsan pre-potansiyel kök hücrelerini nöronlara dönüştürmek için kullanılan boyama protokolleri genellikle karmaşık ve zahmetlidir. Tesadüf eseri, insan pre-potansiyel kök hücrelerinden nöronlar elde etmek için oldukça basit bir prosedüre rastladık.

Teknik açıdan, bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı kolay uygulanabilir, hızlı ve maliyet etkin olmasıdır. Aynı zamanda, prosedür laboratuvardan Dr MI Z tarafından sunulacaktır. Yazılı protokolde belirtildiği şekilde EB oluşum ortamını ve farklılaşma ortamını hazırlayın.

hPSC'leri, Matrigel kaplı plaklarda m-conditioned medium gibi feeder-free koşullarda veya kimyasal olarak tanımlanmış kültür sistemlerinde, sub-konfluen ve aktif büyüme koşulları altında büyütün. Steril bir plastik pipet ucu ve stereo mikroskop kullanarak, kendiliğinden farklılaşmış kolonileri mekanik olarak uzaklaştırın. Geriye kalan farklılaşmamış kolonileri PBS ile yıkayın ve tek hücrelere ayrıştırmak için bir x rock inhibitörü içeren Accutane kullanın.

Tek hücreleri 200 G'de iki dakika boyunca santrifüj ederek çöktürün ve küçük bir hacim EB oluşturma ortamında yeniden süspande edin. Hücre titresini belirlemek için bir hemositometre kullanın. Mililitre başına 40.000 ile 80.000 hücre arasında bir titreye ulaşmak için kalan EB oluşturma ortamına ek hücreler ilave edin.

Çok kanallı bir pipet kullanarak 96 kuyucuklu V tabanlı bir plakadaki her kuyucuğa, kuyucuk başına 4.000 ila 8.000 hücre düşecek şekilde 100 µL aktarın. Tüm hücrelerin kuyucukların dibinde toplanması için plakayı, salınımlı bir plaka santrifüjünde 400 G'de bir dakika boyunca döndürün. Hücreleri bir inkübatöre aktarın ve EBS'lerin oluşması için gece boyunca bekletin; ertesi gün stereo mikroskop altında kontrol edin.

EBS'leri toplayın ve küçük bir hacim içinde, iki mililitre diferansiyasyon ortamı içeren 3,5 santimetrelik bir bakteriye plağına aktarın. Plağı nazikçe döndürerek hücreleri yıkayın. Ultra düşük yapışmalı bir plağın her kuyucuğuna 100 mikrolitre diferansiyasyon ortamı ekleyin.

Stereo mikroskop altında 96 kuyucuklu plakanın alt kısmı. EBS'yi yıkama kabından 96 U kuyucuklarına küçük hacimlerde aktarın. Nöroektoderm oluşumunun dördüncü günde gerçekleşmesi için EBS'yi dört gün boyunca inkübe edin.

Hücreleri farklılaşma ortamı ile yıkayın ve 12 kuyucuklu plaka gibi matrigel kaplı çoklu titrasyon plakasının kuyucuklarına tek tek ekin. Nöronların rahatsız edilmeden büyümesine olanak sağlamak için hücreler kuyucuklar içinde eşit şekilde dağıtılmalıdır. EBS'nin oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika boyunca matrigele gevşekçe tutunmasını bekleyin.

Ardından plakayı dikkatlice inkübatöre aktarın. Nöronlar, önümüzdeki dört gün içinde plakaya ekilen EBS'den radyal bir şekilde büyüyecektir. Daha önce, birçok diğer çalışma ile uyumlu olarak, H PSClerden elde edilen EBS'lerin, H HPClerin düşük yapışmalı kaplara rutin olarak bölünmesiyle oluşan agregatların yeniden ekilmesiyle basitçe oluşturulabileceğini göstermiştik.

Bu durum genellikle hücre boyutlarının geniş bir dağılım göstermesiyle sonuçlanır. Bir diğer sorun ise, süspansiyonda tutulan EB'lerin birbirleriyle kümeleşme eğiliminde olması ve bunun daha yüksek boyut heterojenliğine yol açmasıdır; bunu önlemek için tek hücreli hPSC'ler düşük yapışmalı kuyucuklara ekilmiş, ancak bu durum EB oluşumunun gerçekleşmemesi ve hücre ölümüyle sonuçlanmıştır. Bununla birlikte, hücre sağkalım molekülü Y 2 7 6 3 2'nin, hESC'lerden EB oluşumunu artırdığı gösterilen polivinil alkol ile kombine edilmesi, tek hücreli hESC süspansiyonlarından gecelik süre boyunca EB'lerin oluşmasını sağlamıştır.

Kullanışlı bir şekilde, bu çoklu titrasyon plak formatındaki EB boyutları, kuyuk başına farklı sayıda hücre yerleştirilerek sıkı bir şekilde kontrol edilebilmektedir. Geleneksel tekniklerin kullanımının aksine, EB'ler ultra düşük yapışma özellikli 96'lı U plaklara aktarıldıktan sonra, F-G-F-E-R-K-T-G, TGF beta SMA two ve BP SMA one inhibitörlerinden oluşan küçük moleküllü bir kokteyl kullanılarak nöroektoderm oluşumu indüklenmiş ve ardından hücrelerin nöronlar oluşturması için matrigel üzerine ekilmesine olanak sağlanmıştır. Yaklaşık 8,000 hücreden EB oluşumunun başlatılması, ekilen EB'lerden belirgin nöronal uzantıların gelişmesiyle karakterize edilen en iyi nöronal farklılaşma kapasitesini sağlamıştır.

Plaklama sonrası azalmış nekrotik EB merkezleri ile B rrn three A ve beta three tubulin gibi duyusal ve pan-nöronal belirteçlerin yüksek ekspresyonu gözlemlenmiştir. Genel nöronal farklılaşma verimlilikleri, şu ana kadar hem HSC'ler hem de HI PSC'ler için uygulanabilir olan orijinal prosedürle karşılaştırılabilir görünmektedir. Üç bağımsız HPSC hattı, HES ve HIPS hücreleri çok kuyucuklu prosedürde başarıyla test edilmiş olsa da, hücre hattına bağlı değişkenlik ve farklılaşma verimlilikleri genel olarak dışlanamaz.

Bu şekil, tek hücreler halinde ekilen ve yaklaşık %60 verimlilikle başarıyla diferansiye edilen, dördüncü gün ayrıştırılmış tekli nöroektodermal hücreleri göstermektedir. Çoklu titrasyon platformunda EBS kullanımı başlangıçta biraz eğitim gerektirmektedir, ancak bir süre sonra bunun oldukça kolay olduğunu göreceksiniz.