Автоматизированный анализ динамических Ca ^{2 +} Сигналы в последовательности изображений

Общей целью данного эксперимента является анализ активности эндотелиального кальция в коронарных артериях свиней с помощью автоматизированного анализа ROI. Это достигается путем рассечения и вскрытия коронарных артерий свиньи для измерения активности эндотелиального кальция в качестве второго этапа. На полученных измерениях кальция проводится автоматизированный анализ ROI, в результате которого получается суммарный выход активности кальция.

Далее на выходе запускаются программные скрипты для статистического анализа и графической визуализации результатов анализа активности кальция, которые показывают переходные параметры кальциевого сигнала на основе автоматизированного анализа ROI и статистической обработки. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как ручной анализ рентабельности инвестиций, заключается в том, что автоматизированный анализ является более быстрым, всеобъемлющим и менее подверженным ошибкам пользователя. Во время этой процедуры собранные правые желудочки свиньи помещают в донную чашку для вскрытия A-P-D-M-S, содержащую кучи буферизованного физиологического раствора.

Под стереомикроскопом удалите сегмент левой передней нисходящей коронарной артерии, рассекая его из окружающих слоев сердечной ткани. Следите за тем, чтобы не проколоть стенку сосуда. Затем поместите блок PDMS в чашку для вскрытия и с помощью иглы приколите его ко дну.

Добавьте в блюдо буфер. Затем разрежьте вольфрамовую проволоку диаметром примерно 40 микрон на 12 отрезков длиной 0,3 сантиметра, образуя микробулавки, и поместите их в чашку. С помощью щипцов закрепите один конец сегмента сосуда к блоку с помощью микроштифта.

Осторожно вставьте маленькие пружинные ножницы в просвет сосуда и разрежьте продольно вниз одну сторону сосуда для того, чтобы полностью открыть его. После этого ориентируйте открытый сегмент сосуда эндотелием вверх. С помощью оставшихся микробулавок закрепите границы открытого сегмента сосуда к блоку таким образом, чтобы сосуд образовывал плоский прямоугольник.

Затем приготовьте один миллилитр раствора для загрузки гриппа в 4:00 утра. Поместите весь блок в загрузочный раствор примерно на 40 минут при комнатной температуре в темноте после загрузки, промойте блок и кучу буферизованного PSS в течение пяти-10 минут. Затем установите блок на распорки толщиной от 50 до 100 микрон в стеклянную нижнюю камеру, содержащую кучу буферизованного PSS.

Поместите камеру на предметный столик инвертированного микроскопа, оснащенного для конфокальной визуализации, и сфокусируйтесь на слое эндотелиальных клеток с помощью программного обеспечения для получения последовательности конфокальных изображений, захватите покадровые последовательности изображений базальной относительной флуоресценции в течение трех минут при 20-кратном увеличении и частоте кадров восемь кадров в секунду. После трехминутной регистрации базальной флуоресценции замените в куче буферизованный раствор ПСС таким же объемом 100 пикомолярного вещества Р, растворенного в кучах буферизованного ПСС и запишите еще три минуты. В этой процедуре последовательность изображений флуоресцентной активности кальция из программного обеспечения для конфокального сбора данных выполняется в виде восьмибитного файла формата TIFF с оттенками серого без информации о масштабе.

Затем откройте изображение J. Нажмите кнопку «Открыть» в меню файла и выберите соответствующую последовательность изображений в окне проводника. Чтобы просмотреть последовательность изображений на изображении J, определите подходящий ROI с помощью инструмента прямоугольного ROI для оценки верхней и нижней границ пространственного разброса активности в последовательности изображений. Далее создайте новую папку на жестком диске компьютера и добавьте последовательность изображений в директорию папки.

На изображении J нажмите на окно плагинов. Затем нажмите lc pro. Чтобы начать анализ, введите значение диаметра ROI и выберите пороговое значение фильтра после слова.

Установите флажок «Лечение лекарственным препаратом» и введите значения временных точек непосредственно до и после добавления препарата. Затем нажмите OK и введите каталог последовательности изображений в окно проводника. На этом шаге загрузите R версии 3.0 0.2 и установите его.

Затем откройте 32-битную версию R.Next click файл. Затем откройте скрипт и выберите скрипт trace plot RR для генерации графических экспериментальных отчетов. Установите пакеты calibrate и gpls, выбрав пакеты.

Установите пакеты и выберите соответствующие пакеты. Нажмите кнопку Файл, затем измените команду директории и используйте окно проводника для выбора директории, которая соответствует выходным данным анализа lc pro. Затем нажмите на окно скрипта, а затем команду run all, чтобы запустить скрипт здесь.

Покадровые изображения последовательности входных изображений базального интервала выборки, за которым следует интервал отбора проб вещества, стимулированного P, показаны в оттенках серого; последовательности покадровых изображений лучших лизов для базального и стимулированного интервалов были визуализированы с помощью lc Pro, а здесь показаны зависящие от времени масштабированные кривые интенсивности от каждого автоматически позиционированного ROI, гистограммы от максимальной амплитуды пиковой амплитуды при половине максимального и максимального пространственного разброса как для контроля, так и для вещества. Были визуализированы P-стимулированные события из репрезентативного эксперимента. Использование R для графической обработки, вывод из lc Pro.

Примечательно, что стимуляция веществом Р увеличивала количество событий и стоила значительного сдвига вправо по медиане амплитуды и продолжительности по тесту Уитни. При выполнении этой процедуры важно помнить о минимизации артефактов изображения из-за движения фокальной плоскости или неправильных настроек контрастности, так как это может сильно повлиять на результаты анализа.