Name: Electrofisiología en aislados Preparativos Cord-tronco cerebral espinal de roedores recién nacidos permite la grabación de salida de red neuronal Respiratorio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Aprende electrofisiología en preparaciones aisladas de tronco cerebral-médula espinal de roedores recién nacidos para registrar la salida motora respiratoria. Este método permite evaluar estímulos y realizar investigaciones farmacológicas sobre el control respiratorio.

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Los autores agradecen sinceramente a los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (MOP 130258 y a la Fundación Star para la Investigación en Salud Infantil, junto con la Fundación Molly Towell, por la provisión del centro de investigación y el apoyo financiero. Los autores también agradecen sinceramente al Dr. Kinkead Richard por la revisión de manuscritos y sus consejos.

Este método requiere el uso de sujetos animales, se admiten por el Comité de Ética Animal de la Universidad Laval (protocolo # 2012-170). 1. Instalación y Preparación <ol><li> Soluciones <ol><li> Preparar soluciones madre aCSF de acuerdo con las siguientes recetas 7,17. Otras recetas con variaciones de concentración están disponibles en la literatura. Soluciones tienda de valores a 4 ° C durante hasta un mes. <ol><li> Solución de sal: añadir 75,39 g de NaCl (129 mM final); 2,5 g de KCl (3,35 mM final); 0,81 g de NaH2PO4 (0,58 mM final); 2,33 g de MgCl2 (1,15 mM final); 1,85 g de CaCl2 (1,26 mM). Disolver en 800 ml de agua destilada luego llenar a 1 l con agua destilada. </li><li> Solución de bicarbonato: añadir 17,65 g de NaHCO 3 (21 mM final). Disolver en 900 ml de agua destilada y luego llenar hasta 1 L con agua destilada. Las variaciones de la concentración de bicarbonato resultarán en variaciones de pH. </li><li> Solución de glucosa: añadir 54,06g de glucosa (30 mM final). Disolver en 400 ml de agua destilada y luego llenar hasta 500 ml con agua destilada. </li></ol></li><li> Preparar LCRa por dilución de 100 ml de solución de sal, 100 ml de solución de bicarbonato, y 50 ml de solución de glucosa en 1 L de agua destilada. Almacenar a 4 ° C hasta su uso. </li><li> Preparar un electrodo de vidrio calentando y estirando un tubo de vidrio hasta que se rompe. Lijar la punta antes de su uso. El electrodo se puede reutilizar tantas veces como el tiempo que se mantiene limpio. </li></ol></li><li> Configuración experimental Nota: Los datos de configuración se presentan en la Figura 2. <ol><li> Encienda el amplificador, promediador, sistema de adquisición de datos, control de temperatura y de la bomba en movimiento. Compruebe la amplificación de la señal (ganancia = 10.000), la filtración (de bajo umbral, 10 Hz; umbral alto, 5 kHz), y la tasa de muestreo de la conversión de analógico a digital de la señal en bruto (2,5 kHz). </li><li> Llene una botella con LCRa y la burbuja con carbógeno (95% O 2 </sub&gt;, 5% de CO 2). Inducir un bubbled- y se calentó-LCRa flujo en la cámara de grabación (volumen de 5 ml) a 4 ml / min. Mantener la temperatura en la cámara de registro a 26 (± 1) ° C. pH debe ser 7,4 en estas condiciones estándar. </li><li> Mantenga 50 ml de RT y carbógeno-burbujear LCRa en una jeringa de 50 ml, cerca de la cámara de disección. </li><li> Encienda el ordenador e inicie el software de grabación. </li></ol></li></ol> 2. Disección <ol><li> Pesar y determinar visualmente el sexo del animal (los machos tienen un ano-genital distancia más larga, mientras que las hembras tienen una distancia ano-genital corta; machos genitales son a menudo oscuro, mientras que los genitales femeninos son de color rosa). </li><li> Anestesiar al roedores recién nacidos por una de las siguientes opciones: crioanestesia (sumergir completamente el animal en hielo durante 4 - 5 min 18), inyección (equitensine a 4 ml / kg) 19 o la inhalación de anestésicos volátiles (isoflurano 20 o éter 21). Confirm un plano adecuado de anestesia por la ausencia de un reflejo retirada de la pata. </li><li> Colocar el animal en el banco, la cara ventral hacia abajo. Sección la parte rostral de la cabeza coronalmente con un bisturí en el nivel de bregma (visible a través de la piel y el cráneo). Realice este paso inmediatamente después se anestesia el animal. </li><li> Sección coronal del cuerpo con un bisturí en virtud de los miembros anteriores. </li><li> Quite la piel, los músculos, los tejidos grasos y víscera con tijeras y alicates quirúrgicos y delgadas. Desde los huesos son suaves a esta edad, tenga cuidado de no dañar el sistema nervioso. Realice este paso en el banquillo. </li><li> Colocar la preparación en la cámara de disección. Utilice la LCRa almacenado en la jeringa para oxigenar la preparación. A partir de este punto hasta el final de la grabación, usar un microscopio. </li><li> En la cara dorsal de la preparación, corte el cráneo y las vértebras de la rostral a la parte caudal lo largo del eje medio con tijeras y pinzas quirúrgicas y delgadas. Abra el cráneo cortey vértebras para exponer el tejido nervioso. Utilice la LCRa strored en la jeringa para oxigenar la preparación. </li><li> Con los alicates, quite la membrana aracnoide, un tejido delgado que cubre la superficie del tejido nervioso. Conserve la piamadre y los vasos sanguíneos contra el tejido nervioso. Utilice la LCRa almacenado en la jeringa para oxigenar la preparación. </li><li> Colocar la preparación con el dorsal boca abajo, y cuidadosamente hacer caer el tronco del encéfalo y la médula espinal mediante la reducción de los nervios y el tejido conectivo con las tijeras mientras mantiene la preparación en su lugar. Un enfoque dorsal también es posible. Mantener las raíces y los nervios el mayor tiempo posible. Retire los huesos para aislar el tronco del encéfalo y la médula espinal. Utilice la LCRa almacenado en la jeringa para oxigenar la preparación. </li><li> Retire el cerebelo y el restante estructuras rostrales seccionando con el bisturí. Utilice la LCRa almacenada en la aguja para oxigenar la preparación. </li><li> Opcionalmente dependiendo de experimendiseño tal, retire el puente con el bisturí por una sección anterior de la corona a la arteria cerebelosa inferior 22. Tenga en cuenta que el mantenimiento de todo el puente se ralentizará el ritmo en ratas y totalmente inhibirla en ratones. Las preparaciones que incluyen sólo la parte caudal de la protuberancia muestran una actividad respiratoria como con una frecuencia estable a la raíz C4. </li></ol> 3. Grabación <ol><li> Colocar la preparación en la cámara de grabación, ventral hacia arriba. Fijar la preparación con alfileres en la parte más baja de la médula espinal y el rostral-la mayor parte del tronco cerebral. </li><li> Usando una jeringa vinculado al electrodo por su aguja, inducen una depresión en el electrodo (diámetro de la punta de vidrio: 150-225 micras) tirando de la jeringa de pistón, con el fin de llenar parcialmente el electrodo con LCRa. </li><li> El uso de un micromanipulador, colocar cuidadosamente el electrodo cerca de una de las cuartas raíces ventrales. Otras raíces ventrales también podrían presentar una actividad respiratoria como (e.g., nervio craneal XII, C1 raíz ventral). </li><li> Inducir una depresión en el depósito de electrodo a través de la jeringa tirando del émbolo con el fin de aspirar suavemente el rootlet nervio. A continuación, mueva con cuidado el electrodo para aplicar contra la médula espinal. Nota: Lo ideal sería que el tamaño de la rootlet coincide con el tamaño de la abertura del electrodo y por lo tanto crea un sello entre los compartimentos internos y externos del electrodo. Desde amplificadores diferenciales se utilizan comúnmente para tales grabaciones, cualquier abertura entre el interior del electrodo y la cámara de grabación reduce la calidad de la señal y hace que sea difícil eliminar el ruido de fondo. </li><li> Inicie la grabación. </li><li> Graba el ritmo producido por la preparación en condiciones de normoxia (es decir, LCRa burbujeó con carbógeno: 95% O 2 y 5% de CO 2) durante al menos 20 min para determinar los parámetros basales de la preparación. </li><li> Cambie la perfusión de LCRa carbógeno-burbujear aLCRa estímulo (es decir, burbujeado con 95% N 2 y 5% de CO 2 para el estímulo hipoxia) durante 15 min. Alterar duración de la exposición dependiendo del protocolo experimental. Anote la duración de la exposición en la grabación y animal hoja de datos. Utilice tubos de acero inoxidable entre la botella LCRa y la cámara siempre que sea posible para evitar la difusión del gas al exterior del tubo. </li><li> Cambie la perfusión de nuevo a norma LCRa carbógeno-burbujear durante al menos 15 minutos para una grabación de recuperación. Anota esto en la grabación y animal hoja de datos. </li><li> Finalice la grabación. </li></ol> 4. Análisis estadístico <ol><li> A partir de la señal integrado, calcular la frecuencia como el número de ráfagas por minuto (expresado en ráfagas / min), la amplitud como la diferencia entre la línea de base y el pico de la ráfaga (expresado en mV), la duración de la ráfaga como la duración desde el principio hasta el final de la ráfaga (expresado en s), el área de ráfaga como el área bajo la curve de la ráfaga de la señal integrada (expresado en mV · s) (Figura 3). </li><li> Calcular la frecuencia, amplitud, duración de la ráfaga y la zona de la explosión bajo normóxico (línea de base), hipóxica (estímulo) y post-hipóxico condiciones (post-estímulo) de recuperación como el promedio de los últimos 5 minutos de las grabaciones para cada condición. No analizar la primera porción de cada condición porque hay un retraso entre la conmutación de la perfusión y LCRa homogeneización en la cámara de grabación. </li><li> Expresar entonces estímulo (es decir, la hipoxia) y post-estímulo (es decir, post-hipóxicas) los valores de recuperación en porcentaje de los valores de línea de base para la grabación correspondiente. Exprese los resultados como medias ± SD </li></ol>

<ol><li>Feldman, J. L., Del Negro,, A, C., Gray, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+rhythm+of+breathing%3A+so+near%2C+yet+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far.</a> Annu Rev Physiol. 75, 423-452 (2013).</li>
<li>Taylor, A. C., Kollros, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+in+the+normal+development+of+Rana+pipiens+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Stages in the normal development of Rana pipiens larvae.</a> Anat Rec (Hoboken). 94, 7-13 (1946).</li>
<li>Takeda, R., Remmers, J. E., Baker, J. P., Madden, K. P., Farber, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+potentials+of+bulbar+respiratory+neurons+of+the+turtle%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic potentials of bulbar respiratory neurons of the turtle.</a> Respir Physiol. 64, 149-160 (1986).</li>
<li>Bouverot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+breathing+in+birds+compared+with+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Control of breathing in birds compared with mammals.</a> Physiol Rev. 58, 604-655 (1978).</li>
<li>Adrian, E. D., Buytendijk, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+changes+in+the+isolated+brain+stem+of+the+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Potential changes in the isolated brain stem of the goldfish.</a> J Physiol. 71, 121-135 (1931).</li>
<li>Suzue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+rhythm+generation+in+the+in+vitro+brain+stem-spinal+cord+preparation+of+the+neonatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat.</a> J Physiol. 354, 173-183 (1984).</li>
<li>Fournier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gestational+stress+promotes+pathological+apneas+and+sex-specific+disruption+of+respiratory+control+development+in+newborn+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gestational stress promotes pathological apneas and sex-specific disruption of respiratory control development in newborn rat.</a> J Neurosci. 33, 563-573 (2013).</li>
<li>Caravagna, C., Kinkead, R., Soliz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-natal+hypoxic+activity+of+the+central+respiratory+command+is+improved+in+transgenic+mice+overexpressing+Epo+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Post-natal hypoxic activity of the central respiratory command is improved in transgenic mice overexpressing Epo in the brain.</a> Respir Physiol Neurobiol. 200, 64-71 (2014).</li>
<li>Onimaru, H., Arata, A., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+mechanisms+of+respiratory+rhythm+generation%3A+an+approach+using+in+vitro+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal mechanisms of respiratory rhythm generation: an approach using in vitro preparation.</a> Jpn J Physiol. 47, 385-403 (1997).</li>
<li>Onimaru, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+respiratory+center+using+isolated+brainstem-spinal+cord+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Studies of the respiratory center using isolated brainstem-spinal cord preparations.</a> Neurosci Res. 21, 183-190 (1995).</li>
<li>Ballanyi, K., Onimaru, H., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+network+function+in+the+isolated+brainstem-spinal+cord+of+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Respiratory network function in the isolated brainstem-spinal cord of newborn rats.</a> Prog Neurobiol. 59, 583-634 (1999).</li>
<li>Viemari, J. C., Burnet, H., Bevengut, M., Hilaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+maturation+of+the+mouse+respiratory+rhythm-generator%3A+in+vivo+and+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Perinatal maturation of the mouse respiratory rhythm-generator: in vivo and in vitro studies.</a> Eur J Neurosci. 17, 1233-1244 (2003).</li>
<li>Rybak, I. A., Abdala, A. P., Markin, S. N., Paton, J. F., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+and+state-dependent+mechanisms+for+respiratory+rhythm+and+pattern+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial organization and state-dependent mechanisms for respiratory rhythm and pattern generation.</a> Prog Brain Res. , 165-201 (2007).</li>
<li>Hilaire, G., Viemari, J. C., Coulon, P., Simonneau, M., Bevengut, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+respiratory+rhythm+generator+by+the+pontine+noradrenergic+A5+and+A6+groups+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of the respiratory rhythm generator by the pontine noradrenergic A5 and A6 groups in rodents.</a> Respir Physiol Neurobiol. 143, 187-197 (2004).</li>
<li>Okada, Y., Kawai, A., Muckenhoff, K., Scheid, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+pons+in+hypoxic+respiratory+depression+in+the+neonatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of the pons in hypoxic respiratory depression in the neonatal rat.</a> Respir Physiol. 111, 55-63 (1998).</li>
<li>Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diencephalic+and+mesencephalic+influences+on+ponto-medullary+respiratory+control+in+normoxic+and+hypoxic+conditions%3A+an+in+vitro+study+on+central+nervous+system+preparations+from+newborn+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat.</a> Neuroscience. 132, 843-854 (2005).</li>
<li>Somjen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+regulation+in+the+brain%3A+implications+for+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology.</a> Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).</li>
<li>Danneman, P. J., Mandrell, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+five+agents%2Fmethods+for+anesthesia+of+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats.</a> Lab Anim Sci. 47, 386-395 (1997).</li>
<li>Formenti, A., Zocchi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error+signals+as+powerful+stimuli+for+the+operant+conditioning-like+process+of+the+fictive+respiratory+output+in+a+brainstem-spinal+cord+preparation+from+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats.</a> Behav Brain Res. 272, 8-15 (2014).</li>
<li>Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+hyperoxic+exposure+reconfigures+the+central+respiratory+network+contributing+to+intolerance+to+anoxia+in+newborn+rat+pups%5BTitle%5D)+AND+%22J+App+Physiol%22%5BJournal%5D)">Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups.</a> J App Physiol. 116, 47-53 (2014).</li>
<li>Umezawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orexin-B+antagonized+respiratory+depression+induced+by+sevoflurane%2C+propofol%2C+and+remifentanil+in+isolated+brainstem-spinal+cords+of+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats.</a> Respir Physiol Neurobiol. 205, 61-65 (2015).</li>
<li>Ruangkittisakul, A., Secchia, L., Bornes, T. D., Palathinkal, D. M., Ballanyi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+on+extracellular+Ca2%2B%2FK%2B+antagonism+of+inspiratory+centre+rhythms+in+slices+and+en+bloc+preparations+of+newborn+rat+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dependence on extracellular Ca2+/K+ antagonism of inspiratory centre rhythms in slices and en bloc preparations of newborn rat brainstem.</a> J Physiol. 584, 489-508 (2007).</li>
<li>Cayetanot, F., Bodineau, L., Frugiere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-HT+acting+on+5-HT%281%2F2%29+receptors+does+not+participate+in+the+in+vitro+hypoxic+respiratory+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">5-HT acting on 5-HT(1/2) receptors does not participate in the in vitro hypoxic respiratory depression.</a> Neurosci Res. 41, 71-78 (2001).</li>
<li>Onimaru, H., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+cell+recordings+from+respiratory+neurons+in+the+medulla+of+brainstem-spinal+cord+preparations+isolated+from+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+%3A+European+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Whole cell recordings from respiratory neurons in the medulla of brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats.</a> Pflugers Archiv : European journal of physiology. 420, 399-406 (1992).</li>
<li>Paton, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythmic+bursting+of+pre-+and+post-inspiratory+neurones+during+central+apnoea+in+mature+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rhythmic bursting of pre- and post-inspiratory neurones during central apnoea in mature mice.</a> J Physiol. 502 (Pt 3), 623-639 (1997).</li>
<li>Morin-Surun, M. P., Boudinot, E., Kato, F., Foutz, A. S., Denavit-Saubie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+NMDA+receptors+in+the+respiratory+phase+transition+is+different+in+the+adult+guinea+pig+in+vivo+and+in+the+isolated+brain+stem+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of NMDA receptors in the respiratory phase transition is different in the adult guinea pig in vivo and in the isolated brain stem preparation.</a> J Neurophysiol. 74, 770-778 (1995).</li>
<li>Otsuka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+volatile+anesthetics+on+respiratory+activity+and+chemosensitivity+in+the+isolated+brainstem-spinal+cord+of+the+newborn+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hokkaido+Igaku+Zasshi%22%5BJournal%5D)">Effects of volatile anesthetics on respiratory activity and chemosensitivity in the isolated brainstem-spinal cord of the newborn rat.</a> Hokkaido Igaku Zasshi. 73, 117-136 (1998).</li>
<li>Gestreau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Task2+potassium+channels+set+central+respiratory+CO2+and+O2+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Task2 potassium channels set central respiratory CO2 and O2 sensitivity.</a> PNAS. 107, 2325-2330 (2010).</li>
<li>Caravagna, C., Soliz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+and+MEK+molecular+pathways+are+involved+in+the+erythropoietin-mediated+regulation+of+the+central+respiratory+command%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">PI3K and MEK molecular pathways are involved in the erythropoietin-mediated regulation of the central respiratory command.</a> Respir Physiol Neurobiol. 206C, 36-40 (2014).</li>
<li>Tree, K., Caravagna, C., Hilaire, G., Peyronnet, J., Cayetanot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anandamide+centrally+depresses+the+respiratory+rhythm+generator+of+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anandamide centrally depresses the respiratory rhythm generator of neonatal mice.</a> Neuroscience. 170, 1098-1109 (2010).</li>
<li>Arata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+activity+of+the+neonatal+dorsolateral+pons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Respiratory activity of the neonatal dorsolateral pons in vitro.</a> Respir Physiol Neurobiol. 168, 144-152 (2009).</li>
<li>Onimaru, H., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+functional+neuron+group+for+respiratory+rhythm+generation+in+the+ventral+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel functional neuron group for respiratory rhythm generation in the ventral medulla.</a> J Neurosci. 23, 1478-1486 (2003).</li>
<li>St-John, W. M., Paton, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizations+of+eupnea%2C+apneusis+and+gasping+in+a+perfused+rat+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterizations of eupnea, apneusis and gasping in a perfused rat preparation.</a> Respir Physiol. 123, 201-213 (2000).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos ni conflictos de intereses que divulgar.

La cuantificación precisa de la actividad respiratoria puede ser un reto. De hecho, la respiración es una función que puede ser tanto automática y voluntaria, y que se modula en función del entorno, las necesidades del cuerpo, el estado emocional y el comportamiento. La ventaja de esta técnica es el aislamiento de los elementos neurales responsables de producir el comando respiratorio. Por lo tanto, los registros electrofisiológicos de preparaciones de médula espinal y del tronco cerebral-pletismografía son técnicas com...

La respiración es una actividad compleja y vital controlada por el cerebro, lo que permite dioxígeno (O 2) la captación y dióxido de carbono (CO 2) la eliminación. El impulso respiratorio central se genera por una compleja red situada en el tronco cerebral en ambos mamíferos 1, 2 anfibios, reptiles, aves 3 4 5 y peces. Incluso si el estudio de la respiración se puede procesar in vivo, las investigaciones mecanicistas precisas requieren el acceso directo a la red de control respiratorio. Con este fin, Adrian y Buytendijk desarrollaron una preparación goldfish reducida, en el que los electrodos colocados en el registro de la superficie del tronco cerebral el ritmo generado asociado con gill ventilación 5. Este enfoque fue posteriormente adaptada por Suzue en 1984 6 para su uso en roedores recién nacidos. La llegada de esta preparación ha dado lugar a importantes avances en neurobiología respiratorio. Dado que es relativamente simple, la técnica presentada hERE es susceptible de una amplia gama de investigaciones básicas de comportamientos motores rítmicos y sus orígenes en roedores recién nacidos. El objetivo general de este método consiste en registrar el correlato neural de la actividad inspiratoria, un ritmo respiratorio similar llamado respiración ficticio, producida por la cadena respiratoria. Este método se puede emplear en una amplia gama de objetivos de la investigación, la orientación respuestas inspiratorios a variaciones respiratorias o farmacología en ambos de tipo salvaje y transgénicos 7 8 animales. Dado que los experimentos se llevan a cabo a baja temperatura, sin aferentes sensoriales, y en condiciones en las concentraciones de glucosa y de O 2 en el LCRa son altos, se han planteado interrogantes sobre la relevancia fisiológica de la señal grabada. Si bien existen diferencias claras entre in vivo e in vitro condiciones (por ejemplo., La frecuencia de ráfagas de inspiración) el hecho es que la presencia delos elementos centrales de la red respiratoria 6 hacen posible el estudio de un ritmo robusto asociado a una función homeostática vitales 9,10. La razón fundamental detrás del desarrollo y el uso de esta técnica es facilitar el acceso directo a los elementos del tronco cerebral de la red respiratoria, que son difícilmente accesibles in vivo, especialmente en los recién nacidos. El tronco encefálico se coloca en condiciones estrictamente controladas: el ritmo grabado no es modulada por impulsos aferentes periféricas de los pulmones o los cuerpos carótidas, lo que permite el estudio se centre en la unidad central de la respiración en sí 11. Por lo tanto, se utiliza este acceso para aplicar estímulos y registrar la señal de salida. En contraste con pletismografía de grabaciones, el ritmo respiratorio es modulada por todos sus componentes en todo el cuerpo (por ejemplo., Distensión de pulmón, sensores químicos periféricos), por lo que es difícil de aplicar estímulos precisos. En unaewborn rata, el protocolo consiste en registrar la cuarta señal ventral raíz en un tronco cerebral aislada y una médula espinal truncado, mantenido en el fluido cerebro-espinal artificial (ACSF). El ritmo generado por los preparativos de la médula espinal, tronco cerebral se compone de ráfagas lentas individuales que están vinculados a la señal inspiratoria 9. Preparaciones de cordón-tronco cerebral médula aislados se pueden grabar fácilmente en ratas desde el primer día postnatal 0-4 (P0 - P4) 7. Este enfoque se utiliza comúnmente para evaluar la respuesta hipóxica de la red respiratoria, y también la respuesta a la hipercapnia, acidosis o drogas. Un protocolo de hipoxia aguda se presenta aquí. Esta estimulación se obtiene por la captación de O 2 en el LCRa; este enfoque se utiliza comúnmente para evaluar la tolerancia y la capacidad de respuesta a insultos hipóxicas. El protocolo induce una depresión ritmo desde el primer minuto hasta el final de la exposición a la hipoxia (Figura 1) 12. Esta depresión se inviertedurante el post-hipóxica 12 de recuperación. Respecto al diseño experimental, es importante darse cuenta de que el puente de Varolio, situados en la parte rostral del tronco cerebral, tiene una acción inhibidora sobre el generador de ritmo 8. Por lo tanto, los preparativos de la plena tronco cerebral y médula espinal rostral muestran un menor ritmo. La inclusión de la protuberancia en la muestra aislada de la grabación se determina de acuerdo con el objetivo del experimento 13; el estudio de la influencia pontina en la red bulbo raquídeo requeriría grabaciones con y sin el puente de Varolio para comparar los resultados 14. Por otra parte, una de las ventajas de esta técnica es la posibilidad de ampliar la parte rostral de la preparación para incluir mesencefálico y / o regiones diencefálicas 15,16, por lo que es posible evaluar el efecto de estas regiones en la red respiratoria-ponto medular.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>Sigma Aldrich</td><td>761036-5EA</td><td>Uso bajo el capó</td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td>Bioshop SOD002</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Bioshop</td><td>POC888</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Bioshop</td><td>CCL444</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Bioshop</td><td>MAG510</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Bioshop</td><td>SOB999</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Bioshop</td><td>SPM306</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Bioshop</td><td>GLU501</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Linde</td><td>343-02-0006&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT, EE. UU.</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Electrodo de succión</td><td>A-M Systems, Everett, WA, EE. UU</td>. <td>modelo 573000</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador diferencial de CA</td><td>A-M Systems, Everett, WA, EE. UU</td><td>. modelo 1700</td><td></td></tr><tr><td>Promedio móvil</td><td>CWE, Ardmore, PA, EE. UU</td><td>. modelo MA-821</td><td></td></tr><tr><td>Sistema</td> <td>de adquisición de datosDataq Instruments, Akron, OH, EE. UU</td><td>. modelo DI-720</td><td></td></tr><tr><td>LabChart software</td><td>ADInstruments, Colorado Springs, CO, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de prisma</td><td>Graphpad, La Jolla, CA, EE. UU</td><td></td><td></td></tr>. <tr><td>Cámara de disección</td><td>La caja de plástico (por ejemplo, una caja de Petri) servirá</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara de grabación</td><td>Base casera</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kanetec, Bensenville, IL, EE. UU</td><td></td>. MB Micromanipulador World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, EE. UU. Base Kite-R Kanetec, Bensenville, IL, EE. UU. Bomba peristáltica MB Gilson, Middleton, WI, EE. UU. Jaula de Faraday MINIPULS 3 Computadora casera <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

electrofisiología en aislados preparativos cord-tronco cerebral espinal de roedores recién nacidos permite la grabación de salida de red neuronal respiratorio

Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording

Si bien es bien sabido que el impulso respiratorio central se encuentra en el tronco encefálico, varios aspectos de su función básica, desarrollo y respuesta a los estímulos aún no se comprenden completamente. Para superar la dificultad de acceso al tronco encefálico en todo el animal, se realiza el aislamiento del tronco encefálico y parte de la médula espinal. Esta preparación se mantiene en líquido cefalorraquídeo artificial donde se controlan y monitorean los gases, las concentraciones y la temperatura. La señal de salida de la red respiratoria se registra mediante un electrodo de succión colocado en la cuarta raíz ventral. De esta manera, los estímulos se pueden aplicar directamente sobre el tronco encefálico y el efecto se puede registrar directamente. La señal registrada está ligada a la señal inspiratoria enviada al diafragma a través del nervio frénico, y puede describirse como ráfagas (alrededor de 8 ráfagas por minuto). El análisis de estas ráfagas (frecuencia, amplitud, longitud y área bajo la curva) permite una caracterización precisa del efecto del estímulo sobre la red respiratoria. La principal limitación de este método es la viabilidad de la preparación más allá de las primeras etapas postnatales. Por lo tanto, este método se centra en gran medida en el estudio de toda la red sin las entradas periféricas en la rata recién nacida.

Como se ha mencionado en la introducción, una de las ventajas más importantes de esta técnica es el acceso directo al tronco encefálico para aplicar diversos estímulos. Como ejemplo, la hipoxia se aplicó aquí. Figura 1. AB muestra una grabación protocolo completo, con ambas condiciones de normoxia e hipóxicas. 1.CE Figura muestra el ritmo en condiciones de normoxia registrado (es decir, LCRa burbujeó con 95% O 2 y 5% CO 2 a 26 ° C). Como se ha demostrado a...

El impulso respiratorio central se encuentra en el tronco encefálico. La salida motora respiratoria espontánea de un tronco encefálico aislado se registra colocando un electrodo en la cuarta raíz ventral. Este enfoque experimental es valioso para las investigaciones farmacológicas o la evaluación de los desafíos respiratorios y las manipulaciones genéticas en el comportamiento motor rítmico.

Electrofisiología en aislados Preparativos Cord-tronco cerebral espinal de roedores recién nacidos permite la grabación de salida de red neuronal Respiratorio

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to ...

El objetivo general de este procedimiento es registrar el ritmo generado por los núcleos respiratorios del tronco encefálico en ausencia de E periférica en diferentes condiciones. Esto se logra primero eliminando el cuello y la parte superior de la espalda de la rata, donde se encuentra el tronco encefálico. El segundo paso consiste en aislar el sistema nervioso y retirar los huesos craneales y vertebrales.A continuación, coloque el electrodo en la cuarta raíz ventral e inicie la grabación. Finalmente, se utilizan preparaciones de grabaciones electrofisiológicas en el bulbo raquídeo y la médula espinal aislados para mostrar el ritmo generado por el bulbo raquídeo en respuesta a diversos estímulos.Este método puede ayudar a responder una pregunta clave en el campo respiratorio, como si la molécula está implicada en el ritmo. La generación de controles R es el efecto que el extremo médico ejerce sobre el núcleo respiratorio. Inicie este procedimiento colocando una rata recién nacida anestesiada sobre un platillo.Retire inmediatamente el lado rostral de la cabeza a nivel del bgma, en plano coronal, con un bisturí. Luego, retire el cuerpo por debajo de las extremidades anteriores Corona. A continuación, retire los músculos de la piel y los tejidos grasos que cubren el cráneo.A continuación, retire la sustancia viscosa y tenga cuidado de no dañar el sistema nervioso. Luego, transfiera la preparación a la cámara de disección. Coloque la cámara de disección bajo el microscopio.A continuación, aplique el LCR A oxigenado mediante una jeringa para oxigenar la preparación en el lado dorsal del tejido. Corte el cráneo a lo largo del eje medio y ábralo para exponer el tejido nervioso. Realice el mismo procedimiento para las vértebras.Luego, aplique el LCR A oxigenado para oxigenar la preparación. Posteriormente, coloque la preparación con su lado dorsal hacia abajo. Aísle cuidadosamente el cerebro, el bulbo raquídeo y la médula espinal cortando los nervios y el tejido conectivo mientras mantiene la preparación en su lugar.Luego, retire el cerebelo y las estructuras rostrales restantes. Aplique el LCR oxigenado al preparado. En este procedimiento, coloque el tejido nervioso en la cámara de registro con su cara ventral hacia arriba. Fíjelo con alfileres en la parte más baja de la médula espinal y en la parte más rostral del bulbo raquídeo.A continuación, retire la membrana aracnoidea, que es un tejido delgado que recubre la superficie del tejido nervioso. Tenga cuidado de no eliminar la piamadre y los vasos sanguíneos del tejido nervioso. A continuación, llene el electrodo con A CSF.Utilizando un micromanipulador, coloque cuidadosamente el electrodo cerca de la cuarta raíz ventral. Aspire suavemente el filete nervioso utilizando la jeringa. Luego, coloque el electrodo con el filete nervioso contra la médula espinal.Posteriormente, registre las actividades electrofisiológicas generadas por el tejido nervioso bajo condiciones normóxicas durante al menos 20 minutos. Para determinar los parámetros basales del preparado, cambie la solución de perfusión de A CSF burbujeada con carbógeno a A CSF de estímulo hipóxico y registre durante 15 minutos. Después de esto, cambie nuevamente la solución de perfusión a carbógeno estándar.Insuflar una CSF y registrar durante al menos otros 15 minutos antes de finalizar la grabación mostrada. Aquí se muestran las salidas respiratorias registradas del nervio ventral C4 de la preparación del encéfalo y médula espinal de una rata P4 bajo condiciones normóxicas, hipóxicas y de recuperación post-hipóxica. Esta es la señal integrada y esta es la señal bruta.Y aquí se presentan las grabaciones ampliadas y las ráfagas individuales para cada condición tras el desarrollo. Este método allana el camino para que los investigadores en el campo de la respiración exploren los grupos neuronales y los mecanismos moleculares implicados en el control y la generación respiratoria en recién nacidos.

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Research

Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

Una demostración del aislamiento de la médula espinal de ratón neonatal para los estudios electrofisiológicos.

La médula espinal de Electrofisiología

Una demostración de la fabricación y el uso de un electrodo de succión extracelular para medir los registros electrofisiológicos de los cables de la columna vertebral de roedores recién...

Médula Espinal Electrofisiología II: Fabricación de electrodos de aspiración extracelular

Este video muestra grabaciones electrofisiológicas de preparaciones aisladas de tronco encefálico y médula espinal de roedores recién nacidos. La preparación se coloca en una cámara de registro, y los estallidos inspiratorios del tronco encefálico se registran en condiciones de oxigenación y falta de oxígeno utilizando la raíz nerviosa del cuarto ventral en la médula espinal.

Registros electrofisiológicos de preparaciones de tronco encefálico y médula espinal de un roedor recién nacido

Un método quirúrgico se describe para exponer el cráneo ventral en ratas neonatas. El uso de este enfoque es posible abrir una craneotomía para llevar a cabo la electrofisiología aguda y experimentos de microscopía de dos fotones en el tronco cerebral de las crías anestesiados.

Un método para hacer una craneotomía en el cráneo ventral del Neonato Roedores

Este procedimiento se realiza de larga duración in vivo registros intracelulares de las neuronas individuales durante los estados cerebrales fisiológicamente relevantes y después de la abolición total de las actividades eléctricas en curso, lo que resulta en un estado cerebral isoeléctrico. Las constantes fisiológicas del animal son monitoreados cuidadosamente durante la transición a la condición comatosa artificial.

Inducción de un estado isoeléctrico cerebro para investigar el impacto de la actividad endógena sináptica neuronal en la excitabilidad<em&gt; En Vivo</em

Mostramos cómo preparar rodajas oblicuas de la médula espinal en ratones jóvenes. Esta preparación permite la estimulación de las raíces ventrales.

La Preparación de oblicua de la médula espinal ventral de segmentos para Root Estimulación

Aquí, introducimos una técnica novedosa diseñada para registrar la electroencefalografía (EEG) en cachorros epilépticos neonatales de movimiento libre y describir sus procedimientos, características y aplicaciones. Este método permite registrar el EEG durante más de una semana.

Grabación de EEG en Ratas Neonatales que se mueven libremente usando un método nuevo

En este estudio, se presenta la metodología sobre cómo realizar registros electrofisiológicos in vivo en múltiples sitios a partir de la vía hiperdirecta bajo anestesia con uretano.

Agudo<em&gt; In Vivo</em&gt; Grabaciones electrofisiológicas de potenciales de campo locales y actividad de múltiples unidades de la vía hiperdirecta en ratas anestesiadas

Este estudio presenta un método para la grabación simultánea de potenciales de campo local en el cerebro, electrocardiogramas, electromyograms y respirar las señales de una rata libremente móvil. Esta técnica, que reduce los costos experimentales y simplifica el análisis de datos, contribuye a la comprensión de las interacciones entre el cerebro y órganos periféricos.

Grabaciones simultáneas de potenciales de campo Local Cortical, Electrocardiograma, electromiograma y respirar a ritmo de una rata libremente móvil

Este protocolo tanto visualmente comunica la preparación de la médula espinal de la médula oblonga y aclara la preparación de cortes transversales del tronco encefálico de forma integral paso a paso. Fue diseñado para aumentar la reproductibilidad y mejorar la probabilidad de obtener rodajas viables, duraderas, rítmicamente activa para grabación salida neuronal de las regiones respiratorias del tronco encefálico.

Preparación de rítmicamente activa en Vitro Neonatal roedor del médula oblonga-medulares y rebanada fina

Este protocolo describe un método para obtener grabaciones in vivo de una sola neurona de alta densidad a partir del tronco encefálico de ratones con cabeza fija. Este enfoque se implementa para medir el potencial de acción de las neuronas en el gris periacueductal ventrolateral, una región del tronco encefálico inactiva durante el sueño de movimiento ocular rápido (REM), antes y durante la anestesia general.

Registros agudos de electrodos múltiples de una sola unidad del tronco encefálico de ratones con cabeza fija

Aprende electrofisiología en preparaciones aisladas de tronco cerebral-médula espinal de roedores recién nacidos para registrar la salida motora respiratoria. Este método permite evaluar estímulos y realizar investigaciones farmacológicas sobre el control respiratorio.

Electrofisiología en aislados Preparativos Cord-tronco cerebral espinal de roedores recién nacidos permite la grabación de salida de red neuronal Respiratorio (Video) | JoVE Journal

Electrofisiología en aislados Preparativos Cord-tronco cerebral espinal de roedores recién nacidos permite la grabación de salida de red neuronal Respiratorio

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